武夷菌素防治葡萄灰霉病的作用及机理

为了探讨武夷菌素对葡萄灰霉病的防治效果及作用机理,本文通过菌丝生长速率测定、分生孢子萌发抑制测定、胼胝质沉积测定、离体叶片和果实防治等试验,发现武夷菌素可以抑制灰霉病菌的菌丝生长,浓度达到120μg/mL时,对菌丝的抑制作用达到94.3%;当浓度达到100μg/mL时,武夷菌素对葡萄灰霉病菌的孢子萌发抑制率可达到96.0%;通过离体叶片及果实防效试验发现,武夷菌素浓度达到120μg/mL时,防治效果分别为87.5%和96.6%。武夷菌素可以显著降低灰霉病菌的草酸合成能力,导致其致病力减弱,从而减轻灰霉病菌对寄主的侵染。武夷菌素能够通过诱导葡萄叶片的胼胝质沉积,增加葡萄组织的防御能力,从而起到有效防治灰霉病的作用。综上所述,武夷菌素对葡萄灰霉病具有良好的防治效果,可以作为生物防治药剂进行应用推广。

武夷菌素对番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)的作用方式

借助光镜和透射电镜观察了武夷菌素对番茄灰霉菌菌丝生长和分生孢子萌发的形态影响 ,结果表明 ,武夷菌素处理的菌丝异常生长 ,分生孢子萌发的芽管膨大缢缩 ,菌丝体内液泡增多 ;武夷菌素能引起菌丝细胞膜透性的变化 ,造成液体培养基电导率增加 ;同位素标记的14 C 谷氨酸、3 H 葡糖胺和 3 H 腺嘌呤掺入实验表明 ,武夷菌素能抑制菌丝蛋白质的合成 。

原生质体融合提高农抗武夷菌素的效价

从农抗武夷菌素产生菌不吸水链霉菌武夷变种菌株Co-N-31诱变获得两个突变株M35(Leu^-,孢子颜色灰色)和M46(ser^-.孢子颜色灰白色),并以此两突变株为直接亲本在25％ PEG1000诱导下进行种内原生质体融合。M35和M46原生质体再生率分别为3.72％和0.248％,重组频率为55.20％。采用间接法选择营养标记互补的稳定的原养型重组子,并从中获得一株高产菌株F31-24;其效价比原始亲本Co-N-31提高了82％。薄层层析结果表明,菌株F31-24和Co-N-31的发效产物在Rf值为0.50和0.26处均有斑点,但含量有异。测定斑点生物活性证明其均有抑菌活性。温室试验表明,菌株F31-24发酵产物对小麦白粉病的防治效果优于菌株Co-N-31。

武夷菌素对番茄灰霉菌的抑制作用及对番茄抗病性相关酶活性的影响

采用凹陷载玻片法测定了武夷菌素对番茄灰霉菌分生孢子萌发的抑制作用,在离体番茄叶片上测定了被武夷菌素处理后的番茄灰霉菌菌丝和分生孢子致病性的变化以及武夷菌素对番茄幼苗体内抗病性相关酶活性的影响。结果表明:武夷菌素对番茄灰霉菌的分生孢子有较强的抑制作用,其EC50为14.1μg／mL。浓度为100μg／mL的武夷菌素可完全抑制孢子的萌发。武夷菌素能使灰霉菌菌丝和分生孢子的致病性明显下降,同时还能诱导番茄体内抗病性相关酶(SOD、POD、PPO、PAL)活性的增强,提高番茄幼苗的抗病性。

重庆地区茶树病害种类及武夷菌素对茶病的田间控制效果

2005-2007年调查重庆主要茶叶种植区、县茶树病害的发生情况,共查明病害16种,分布频率较高(F>42)的有云纹叶枯病、煤污病、地衣病、轮斑病、炭疽病、白星病和藻斑病等,其中以前4种病害发生最普遍,发病分布频率和病植株率分别达到70%和30%以上,而以云纹叶枯病和轮斑病对茶树的危害最严重.武夷菌素是产自于不吸水链霉菌(Strepromyces ahygroscopicus)的一种无毒性生物杀菌剂,测定该药剂在田间条件下对重庆当地主要茶树叶部病害的防治效果,采用原药的600倍液并按15 L/667 m2的用量对茶树叶面喷雾2次.以对照病叶率计算武夷菌素对茶树云纹叶枯病(Colletotrichum cameliae)、轮斑病(Pesalotiopsis theae)和其它叶斑病的防效,分别为71.33%,65.38%和87.78%;而按病害严重度计算分别为61.02%,77.08%和79.01%7.经统计学显著性测验表明,武夷菌素对这些茶树病害的相对防病效果与多菌灵的病害控制效果没有显著的差异(p>0.05),但处理与对照茶树病害的病叶率和病情指数的差异都达到了极显著水平(p<0.001),这表明武夷菌素对茶云纹叶枯病和轮斑病具有很好的控制效果,可以代替多菌灵在茶叶生产中应用.

2%武夷菌素水剂对草莓白粉病的毒力测定及田间防效

武夷菌素是一种农用抗生素类生物杀菌剂,温室及田间试验表明它对粮食、蔬菜、果树上的多种真菌病害有很好的防治效果,并且已经应用于农业生产中。为了考查其对草莓白粉病的防治效果,进行了室内孢子萌发抑制试验,结果表明武夷菌素能够抑制草莓白粉病菌孢子的萌发,其EC50为9.550 6μg/mL。同时田间药效试验结果表明,2%武夷菌素水剂对草莓白粉病具有良好的防治效果,其300倍液防治草莓白粉病的效果和化学农药10%苯醚甲环唑水分散粒剂相当,武夷菌素200倍液的防效显著高于化学农药,同时对草莓自身的生长发育没有影响。试验表明武夷菌素对草莓白粉病有很好的防治作用,可为生产上防治草莓白粉病和科学用药提供依据。

生物农药武夷菌素对保护地番茄灰霉病的防治效果

为明确生物农药武夷菌素对番茄灰霉病的防治作用,通过室内毒力测定、温室盆栽和田间试验研究了武夷菌素对灰霉病菌的抑制作用和对灰霉病的防治效果。毒力测定结果表明武夷菌素能明显抑制灰霉病菌菌丝的生长,EC50为10.0802μg/mL。温室试验表明,武夷菌素对番茄灰霉病有保护和治疗作用,而且保护作用优于治疗作用;武夷菌素对灰霉病有较长的持效期,400倍液处理番茄8天后再接种的防效仍然达61.32%。田间试验表明,对保护地番茄间隔7天、连续施药3次,第3次施药15天后2%武夷菌素100倍液的防效达83.93%,显著高于35%腐霉利悬浮剂600倍液的防效。此外对番茄果实品质的测定结果表明,使用2%武夷菌素后番茄除有机酸的含量无明显变化外,可溶性固形物、维生素C和可溶性糖等含量都有一定程度的升高。试验表明武夷菌素对番茄灰霉病有很好的防治作用,同时可以提高番茄果实品质,为番茄生产上合理应用生物农药提供了依据。

应用^(60)Coγ射线诱变选育武夷菌素高产菌的研究

武夷菌素是一种广谱、高效、低毒的生物农药,对蔬菜病害及果树、粮食作物病害有着明显的防治效果。但目前生产上所用的武夷菌素产生菌的效价都相对较低,为进一步提高武夷菌素产生菌药效,降低生产成本,研究以L7为出发菌株,采用3种不同剂量(500Gy,1000Gy,1500Gy)的60Coγ射线对其进行诱变处理。通过琼脂块法初筛,从3582株突变株中选育出78株相对高产菌株进行摇瓶复筛,最终选出5株效价最高的菌株(C-28,C-42,C-64,C-75,C-76)进行遗传稳定性测定。5次传代后,结果显示,菌株C-75遗传稳定性较好,能够稳定保持高效价不变(达到5 528μl/L),较出发菌株L7(效价4112μL/L)提高了34.4%。

武夷菌素对玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani生长发育的影响

玉米纹枯病近年来已成为我国很多玉米主产区最重要的病害,而武夷菌素(wuyiencin)是来源于不吸水链霉Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis的一种微生物源类杀菌剂.本研究测试了武夷菌素对玉米纹枯病菌生长发育的影响,结果表明在含有武夷菌素的PDA培养基上,玉米纹枯病菌生长缓慢,菌丝分支致密且部分菌丝尖端出现原生质体渗透;菌丝致病力下降.随着武夷菌素质量浓度的增高,菌丝受抑制程度加重,在培养后期,菌株形成的菌核数量和质量均显著下降.当武夷菌素质量浓度为50 mg/L时,玉米纹枯病菌菌落直径减少75%以上,菌丝致病力降低达99%,形成的菌核数量和质量分别降低67%和61%.武夷菌素可显著抑制玉米纹枯病菌的生长发育,在玉米纹枯病的控制中具有重要的应用潜力.武夷菌素对田间玉米纹枯病的有效防治有待进一步研究.

武夷菌素产生菌Fosmid文库的构建及文库探针的获得

以不吸水链霉菌武夷变种CK-15为材料，提取基因组DNA，经Sau3AI部分酶切后回收35—40kb之间的片段。连接到pCC1FOS载体上，经过包装转染涂布后构建得到了CK-15基因组的Fosmid文库，文库的滴度为8．8×10^5CFU／mL。随机挑取16个阳性克隆，经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切电泳分析，样品插入片段平均长度大于35kh，插入率为100％，符合构建文库的要求。根据多氧霉素、尼克霉素生物合成基因及大环内酯类聚酮合成酶基因（PKS）设计特异性引物，以基因组为模板进行PCR扩增，筛选特异性引物探针。结果用大环内酯类聚酮合成酶基因设计引物扩增出1693bp的片段经Blast比对其与大环内酯类抗生素生物合成基因相似性为95％以上。武夷菌素产生菌CK-15 Fosmid文库的构建及文库探针的获得，为武夷菌素生物合成基因的克隆奠定了基础。

2%武夷菌素水剂防治黄瓜白粉病药效试验

[目的]明确2%的武夷菌素水剂在黄瓜白粉病上的防治效果。[方法]以2%武夷菌素180倍液2、60倍液3、40倍液喷雾为处理,以50%福美双可湿性粉剂500倍液喷雾为常规对照,以清水喷雾为空白对照,施药2次,每次间隔7 d,分别于药前、第1次药后7 d、第2次药后7 d、第2次药后14 d调查黄瓜白粉病的发病情况,并计算防效。[结果]2%武夷菌素水剂对黄瓜白粉病有较好的田间防治效果,可有效控制黄瓜白粉病的蔓延;2%武夷菌素水剂各处理均未对黄瓜产生药害,对黄瓜的生长发育无明显影响,且对其他病虫害或有益生物无直接影响;2%武夷菌素水剂260-340倍液喷雾对黄瓜白粉病的防治效果较好,且成本较低。[结论]2%武夷菌素水剂是防治黄瓜白粉病的一种有效无公害生物农药,可以在生产上推广使用。

应用响应面法优化武夷菌素发酵培养基

为了提高农用抗生素武夷菌素的效价，应用响应面法对武夷菌素发酵培养基进行了优化．首先应用部分因子设计法对武夷菌素发酵培养基中的淀粉、葡萄糖、玉米粉、豆饼粉、化合物A、化合物B、化合物C、MgSO4、FeSO4、NaCl共10种营养成分进行了分析，筛选出葡萄糖和豆饼粉为影响武夷菌素效价的关键因子，然后通过最陡爬坡实验逼进最大响应区域，应用中心组合设计法优化葡萄糖（X2）和豆饼粉（X4）的浓度，得到武夷菌素效价（Y）的二次多项式优化拟合模型，其为：Y=6643．78＋687．42 X2＋275．13 X4—824．69 X2^2-122．45 X2X4—620．94X4^2由该模型求解可知，当葡萄糖27．2g／L、豆饼粉31．8g／L时武夷菌素效价有最大值。于是按这2种关键因子的用量获得优化的培养基，用菌株S-40（原始效价4443gg／mL）比较试验测定表明，在优化的培养基上武夷菌素的效价可提高到6643μg／mL．

武夷菌素对茶树叶枯病菌(Colletotrichum camelliae)生长发育的影响

茶叶枯病是茶树上最重要病害之一.该研究探讨武夷菌素对茶叶枯病菌生长发育的影响.显微观察发现。用武夷菌素处理病菌的分生孢子后,其萌发显著缓慢,萌发出的菌丝形态畸形且伸长受阻.在含有不同稀释浓度(8.3～25.0mg/L)武夷菌素的PDA培养基上,随着药液浓度的升高,病菌菌落生长受到抑制加重,单位菌落的产孢量明显降低,且产生的分生孢子不同程度地畸形.药剂对病菌的抑制效果与药液浓度成正相关.用加入武夷菌素的培养液培养病菌7d后,培养液的相对电导率显著升高(p<0.05),这说明药剂能破坏液体中病菌菌丝的细胞膜结构和通透性.

武夷菌素高产菌株选育及应用研究进展

武夷菌素是一种具有自主知识产权的高效、广谱、低毒生物农药,对粮食、蔬菜和果树及经济作物的真菌病害具有良好的防治效果。本文分别从传统育种和基因工程育种两个方面,介绍了武夷菌素高产菌株的选育研究历程,尤其详细介绍了基因工程育种体系的构建。同时,综述了武夷菌素的田间防治效果,分析了研究和应用过程中存在的问题并提出了解决途径。

不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索及初建

旨在对不吸水链霉菌武夷变种CK-15的遗传转化体系进行初步的探索及建立。首先对内源质粒的存在及对抗生素敏感性进行了测定,结果显示,在不吸水链霉菌武夷变种CK-15中不存在外源质粒。最终确定最适培养基为MS培养基,最适热激温度与时间为50℃热激10 min,37℃温育最适时间为2.5 h,最佳抗生素水溶液覆盖时间为16-18 h,并对转化子进行了验证。

高产武夷菌素wysR基因过表达菌株的筛选及菌株生物特性研究

以武夷菌素生物合成正调控基因wys R过表达菌株为初选材料,通过琼脂块法对2 060个过表达菌株单菌落进行初筛,得到35个优选菌株,再采用摇瓶发酵复筛的方法筛选出9个高产菌株,并通过菌株遗传稳定性分析,最终确定W-273菌株为最优菌株。研究武夷菌素wys R基因过表达菌株W-273的生理生化特征,发现与原始菌株CK-15相比,W-273菌株生长迅速,产孢量增加且产孢时间提前,W-273菌株生长3-4 d即可完成产孢,较菌株CK-15产孢时间提前了3-4 d;电子显微镜观察W-273菌株和CK-15菌株孢子形态不同,W-273菌株孢子呈椭圆形或杆状,CK-15菌株孢子呈圆形;通过摇瓶发酵表明W-273菌株较CK-15菌株代谢旺盛,抗生素产量提高79%-289%,且最佳发酵时间缩短4-8 h。

武夷菌素高产基因工程菌发酵培养基的优化

为进一步提高武夷菌素的产量,以基因工程菌Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis W273为试验菌株,采用单因子试验确定发酵培养基的最适6种营养成分为玉米粉、葡萄糖、黄豆面、氯化铵、碳酸钙和氯化镁;应用SAS软件中的Plackett-Burman设计法,对影响菌株发酵生产武夷菌素的6个因素进行了筛选,确定葡萄糖和碳酸钙为影响摇瓶发酵生产武夷菌素的主要因素。利用响应面分析法对2个主要因素的最佳水平及其交互作用进行研究,建立了二次回归方程,Y=218.18＋270.28X1＋1274.74X2―3.28X12―5.4X1X2―200.98X22,并最终确定最佳培养基配方为玉米粉20 g/L、葡萄糖39 g/L、黄豆面20 g/L、氯化铵4 g/L、碳酸钙2.65 g/L、氯化镁0.4 g/L。以新配方在28℃、220 r/min进行摇瓶发酵60 h后,武夷菌素效价平均值为7215μg/m L,较原始培养基发酵后武夷菌素效价提高了26.5%。

武夷菌素部分生物合成基因簇的克隆和分析

不吸水链霉菌武夷变种Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15是从福建省武夷山土样中分离得到的一株链霉菌,其代谢产物武夷菌素对果蔬真菌病害具有良好的防治效果,但是因其产量低的缺点限制了武夷菌素工业化生产和农业生产中的应用。为了实现利用基因工程培育高产新菌株的目标,首先要获得武夷菌素的生物合成基因。根据大环内酯类抗生素聚酮合成酶基因设计引物筛选菌株CK-15的基因组文库,共获得9个阳性克隆。克隆和测序获得3个较长scaffold片段,序列总长度达53.291 kb,其中包含了14个可能阅读框,通过同源比对证实该序列与S.noursei ATCC 11455的制霉素生物合成基因有很高的同源性。本研究为进一步研究武夷菌素生物合成基因的功能,并通过基因工程培育高产新菌株奠定了基础。

武夷菌素产品的创制与应用

武夷菌素是具有我国自主知识产权的生物农药,先后创制了1%、2%、3%武夷菌素系列产品。作为一种低毒、高效、广谱的核苷类微生物次级代谢产物,对多种作物的真菌性病害具有很好的防治效果。本文总结了四十年来,武夷菌素在产品创制、高产菌株选育、发酵工艺、提取工艺以及田间应用等方面的研究进展,展望了武夷菌素产业化发展过程中存在的问题并分析了接下来的研究重点。

高效液相色谱法测定发酵液中的武夷菌素

建立应用高效液相色谱法测定发酵液中武夷菌素含量方法。色谱柱ZORBAX SB-AQ(4.6mm×250mm i.d.,5μm);柱温25℃;流动相为1.4g/L三氯乙酸水溶液,流速1mL/min;检测波长254nm。将色谱峰面积与武夷菌素质量浓度进行线性回归,表明在0.2～1.6g/L质量浓度范围内线性关系良好,变异系数为0.43%～2.08%,回收率为96.59%～100.57%。