X-Gal在双歧杆菌分离与活菌计数方面的应用研究

利用大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶且活性较高的特性,在NPNL培养基中加入X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)作为底物,双歧杆菌水解底物释放出吲哚,产生颜色反应。双歧杆菌菌落呈深蓝色,乳酸菌和其它细菌一般为白色或淡蓝色。将X-Gal应用于不同样品中双歧杆菌分离和活菌计数进行对比。这种方法能比较准确的反映双歧制品和婴儿粪便中双歧杆菌的数量,并且大大减少了分离鉴别双歧杆菌的工作量。

重组鸡痘病毒活疫苗X-gal染色空斑计数法的建立

建立了一种简易的携带LacZ基因重组鸡痘病毒（rFPV）活疫苗的X-gal染色空斑计数法。rFPV接种次代鸡胚成纤维细胞（CEF）72 h后,加2 mL/L戊二醛固定液室温固定15 min,再加500μg/mL X-gal染色液37℃过夜,倒置显微镜下直接计数蓝染空斑。染色空斑计数法的空斑数是不染色直接计数法的1.6~3.3倍。该方法在重组鸡痘病毒活疫苗研究及其工业化生产检验中具有较大的应用价值。

X-Gal改良MRS培养基结合API50CH鉴定新生儿肠道中双歧杆菌

目的:探讨一种快速鉴别新生儿肠道中双歧杆菌的方法。方法:采集10名健康新生儿粪便样品稀释涂布于添加了氯化锂(LiCl)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的MRS培养基上,厌氧培养后挑单菌落经革兰氏染色、API50CH碳水化合物鉴定试剂条反应和有机酸代谢产物测定鉴定出双歧杆菌种类。结果:改良MRS培养基上的蓝色菌落经鉴定为双歧杆菌,白色菌落鉴定为乳酸菌,10份样品中有9份检出双歧杆菌。结论:该方法准确可靠,可用于快速鉴定新生儿粪便中的双歧杆菌。

一种改良大便双歧杆菌计数方法

目的 :研制一种大便双歧杆菌鉴别计数培养基。方法 :利用大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶且活性较高的特性 ,在自制改良 BS培养基中加入 X- Gal(5 -溴 - 4 -氯 - 3-吲哚 -β- D-半乳糖苷 )作为底物 ,双歧杆菌水解底物释放出吲哚 ,产生颜色反应。结果 :双歧杆菌菌落呈深蓝色 ,乳酸菌和其它细菌一般为白色或淡蓝色。结论 :自制改良 BS培养基上双歧杆菌与乳酸菌及其他细菌菌落有明显的鉴别性 。

混合制剂中快速计数双歧杆菌鉴别培养基的研究

研制了一种混合制剂中快速计数双歧杆菌鉴别培养基。用添加X-Gal的改良MRS培养基和厌氧胶法对4种标准双歧杆菌(长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌)和2种标准乳酸菌(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)分别单独培养、混合培养,结果在X-Gal培养基上,双歧杆菌单独培养及与乳酸菌混合培养双歧杆菌均为白色菌落或浅蓝色菌落,而乳酸菌为蓝色菌落。结果表明,在X-Gal培养基上双歧杆菌和乳酸菌有明显的鉴别性,可用于双歧杆菌和乳酸菌混合制剂的菌落鉴别计数。

一种用磷酸钙法高效转染HEK293T细胞方法的建立

利用磷酸钙转染法将lacZ-pShuttle质粒导入HEK 293T细胞中,实验证明,pH值、DNA纯度、转染后培养时间和甘油休克时间是影响转染效率的重要因素。转染后培养6h进行甘油休克效果最佳,比培养0h直接进行休克转染效率升高584.4%;甘油休克时间为4.5min时转染效果最佳,比不用甘油休克转染效率升高130.8%。通过对影响转染的几个条件进行优化,建立了1种可以高效转染HEK 293T细胞的方法,且简便易行。

一种双歧杆菌鉴别计数培养基的研制

目的 研制一种双歧杆菌鉴别计数培养基。方法 研制的改良 MRS培养基补充了双歧杆菌和乳酸菌需要的特殊营养成分 ,并依据大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶能特异性水解含半乳糖低聚糖的特征 ,加入 5 -溴 - 4-氯 - 3-吲哚 -β- D-半乳糖物质 ,作为底物 ,使双歧杆菌水解底物释放出吲哚 ,产生颜色反应。结果 双歧杆菌菌落呈蓝色 ,乳酸菌一般为白色或淡蓝色。结论 改良 MRS培养基上的双歧杆菌和乳酸菌菌落有明显的鉴别性 。

神经黏附分子NB-3在转基因小鼠脑的发育表达

目的检测NB-3在小鼠大脑组织中不同时期的表达情况。方法采用带LacZ基因的NB-3基因敲除的杂合子小鼠,分别取E12、E14、E16、E18、P0、P7、P14及成年小鼠的脑组织固定,采用X-gal染色方法检测LacZ基因产物β-半乳糖苷酶的表达以显示NB-3的表达及定位。结果1.NB-3在胚胎发育期间从E14开始有微弱的表达,后逐渐在侧脑室周围、皮层、丘脑、下丘脑及海马等部位表达。其中在皮层中的表达主要集中在Ⅱ/Ⅲ、Ⅴ层。2.NB-3在出生后小鼠大脑中的表达明显升高,在P7时表达最高,此后稍有下降直至成年。3.NB-3在成年小鼠大脑组织中的表达分布广泛。表达最强的部位分别是大脑皮层的II/III、V层、梨状皮层、杏仁核周皮质、丘脑、下丘脑以及海马的CA1区等。结论NB-3在发育和成体小鼠中枢神经系统中均有表达,且不同时期的表达量有所不同。提示NB-3在神经系统的发育过程中可能具有重要的作用。

LacZ基因在小鼠骨骼肌中表达的时─空模式

以ＬａｃＺ为报告基因，利用ＤＮＡ重组技术构建了ＬａｃＺ真核表达质粒ｐＣＤＬａｃＺ，ｐＣＤＬａｃＺ肌注小鼠后，Ｘ－Ｇａｌ染色法及半乳糖苷酶定量分析结果表明，ＬａｃＺ基因在小鼠胫前肌中得到表达，并在肌注后第７天左右达到高峰，表达的ＬａｃＺ主要分布于胫前肌近膝关节肌腱结合处，提示肌肉接种基因疫苗应采用纵向，接种部位应接近肌腱结合处。

无辅助病毒HSV-1载体介导LacZ基因在培养皮层神经元中的表达

目的:探讨无辅助单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype 1,HSV 1)载体的包装及其介导LacZ基因在体外培养神经元表达的作用, 解决该载体系统在包装及体外培养神经元应用中的有关问题。方法:将一组含HSV 1基因组的粘粒以限制性内切酶PacⅠ酶切、纯化后,与含LacZ和酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase,TH)及神经微丝(neurofilament,NF)嵌合启动子的HSV 1质粒DNA在脂质体作用下,共转染 2 2细胞;在 34℃条件下培养 72h,收获病毒颗粒。将含病毒颗粒的上清液,加入BHK细胞培养液中,继续培养 24h后,加X gal染液作用 4h,观察表达LacZ基因的蓝染细胞。取培养第 3天的胚胎大鼠大脑皮层神经元,加入含病毒颗粒的培养液,过夜后更换新鲜培养液,分组继续培养 1, 7和 14d,进行X gal染色,光镜下观察。结果:包装形成的病毒颗粒感染BHK细胞, 24h后可见表达LacZ基因的蓝染细胞;感染培养第 3天的皮层神经元,继续培养 1, 7和 14d后均可见蓝染神经元。结论:无辅助病毒包装系统能够使含TH NF嵌合启动子的HSV 1载体形成有效的病毒颗粒,并且在体外培养神经元中持续稳定地表达外源基因,为在神经系统进行基因转移和基因功能研究提供了有效的工具。

用试纸法快速检测β-半乳糖苷酶活性的研究

应用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-gal)试纸建立一种快速检测β-半乳糖苷酶活性的方法。其原理在于酶色原底物X-gal在β-半乳糖苷酶作用下产生蓝色的5-溴-4-氯-3-吲哚。X-gal的价格昂贵,常规法每个平皿的X-gal的用量为3～4mg。该试验以大肠杆菌为阳性对照菌株,无乳链球菌为阴性对照菌株,用试纸法对新疆石河子周边地区牛场分离出的101株链球菌是否产β-半乳糖苷酶进行检测。共筛选出阳性菌21株,检出率为20.79%;阴性菌80株,检出率为79.21%。采用试纸法不仅使X-gal用量大大减少,节省成本,同时操作快速、简便、准确。

牛粪中双歧杆菌检测方法的比较

双歧杆菌在肠道中的生理功能已受到人们的高度关注,奶牛在养殖过程中,饲料、环境等条件会对肠道菌相产生直接影响,牛粪中检测双歧杆菌含量显得尤为重要。动物肠道中的微生物菌群较为复杂,检测中会发生许多干扰。寻找如何准确、快捷的检测方法是我们研究的课题,通过实验,认为在改良MRS培养基中添加一定量的X-Ga(l5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖)因菌落呈蓝色或有蓝色晕而使检测更准确而有效,此方法也可应用于食品中双岐杆菌的检测。

激肽释放酶腺相关病毒载体的构建及病毒滴度的测定

目的 构建人组织激肽释放酶 (HK)腺相关病毒载体 ,并检测其滴度。为HK的真核表达及其临床研究提供实验基础。方法 从带有人HK基因的pBluescriptⅡKS质粒中扩增出HK cDNA ,并将HK cDNA克隆到腺相关病毒载体pAAV MCS中 ,构建pAAV HK表达质粒。并将此表达质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV RC、以及腺病毒辅助质粒pAAV Helper共转染AAV 2 93细胞 ,通过同源重组产生重组HK的腺相关病毒。以pAAV LacZ和pAAV RC、pHelper共转染AAV 2 93细胞 ,对报告基因LacZ用X Gal染色 ,通过蓝染的细胞计算病毒滴度。结果 扩增出的cDNA片段经DNA测序最终确定为HK cDNA。通过LacZ测定HK重组腺相关病毒的滴度为 6 2× 10 7个 /ml。结论 重组HK的腺相关病毒可以在HT 10 80细胞中表达HK ,本实验为今后研究HK的生物学活性及心血管病的基因治疗奠定了基础。

ROSA26小鼠中枢神经系统半乳糖苷酶的表达与分布

目的:观察成年ROSA26小鼠中枢神经系统半乳糖苷酶(X-Gal)的表达与分布。方法:应用X-Gal组织化学结合尼氏染色及免疫组织化学双标技术研究β-gal在该嵌合体脑内的表达与分布特征。结果:X-Gal组织化学染色显示在该线系小鼠脑和脊髓中均广泛表达转基因β-gal活性产物,但以灰质为主。X-Gal和尼氏双重染色表明,β-gal在神经元、室管膜细胞和脉络丛上皮细胞中均有表达。免疫组化进一步显示β-gal广泛表达于神经元中,但在星形胶质细胞中则未见表达。结论:ROSA26小鼠中枢神经细胞稳定而广泛的表达β-gal,此转基因模式动物将可用于神经细胞培养、移植及其它相关神经生物学研究。

百岁老人肠道双歧杆菌分离鉴定研究

为了建立百岁老人肠道双歧杆菌高效分离的技术体系,首先筛选了合理的大便样品采样液,以确保双歧杆菌的数量和活性;其次将杂菌抑制技术和显色技术相结合,快速得到显色菌株,并在初步鉴定的基础上采用16S rRNA对显色菌株进行了鉴定.结果 表明,使用双歧杆菌BS培养基作为采样液能够更有效地分离双歧杆菌,百岁老人的肠道菌相较于婴儿更难分离;使用X-Gal作为指示剂在粪便中分离双歧杆菌的过程中,不只有双歧杆菌菌株显色,得出了显色菌株的大致种类,为肠道益生菌的分离鉴定提供理论和技术支持.

基于Cre/Loxp系统Tyro3、Axl受体酪氨酸激酶转基因小鼠的建立

目的采用大肠杆菌β-半乳糖酶基因LacZ作为报告基因,建立Tyro3、Axl受体酪氨酸激酶含有loxp位点的转基因小鼠。与不同组织特异性Cre小鼠杂交,获得时空性表达Tyro3、Axl的转基因小鼠,为研究其在各个组织中的功能奠定基础。方法构建含有loxp位点的Tyro3、Axl受体酪氨酸激酶质粒,测序正确后,通过显微注射法将插入CAG启动子下游的Geo-STOP-msAxl及Geo-STOP-msTyro3基因的转基因载体注射入BDF1供体鼠受精卵,移植受精卵至ICR受体鼠,待产仔后,通过双引物PCR鉴定F0以及Fn代小鼠的基因型,RT-PCR,X-gal染色观察小鼠组织中LacZ基因,运用WB(Western Blot)检测转基因小鼠和野生型小鼠体内目的蛋白表达的差异。结果获得了含有目的基因的转基因阳性小鼠;通过RT-PCR对阳性小鼠证明LacZ基因的存在;对存在LacZ基因的小鼠进行X-gal染色,在Geo-STOP-msTyro3的脑、睾丸、胸腺中观察到蓝色沉淀,在Geo-STOP-msAxl的脑、心、肾中观察到蓝色沉淀,间接说明目的基因能表达的组织和器官;对双阳性的Geo-STOP-msTyro3、Geo-STOP-msAxl转基因小鼠和野生型小鼠,WB检验证实Tyro3、Axl基因的表达没有差异,说明在加入stop序列之后,Tyro3基因确实存在,而且表达受到抑制。结论成功建立Geo-STOP-msAxl及Geo-STOP-msTyro3酪氨酸受体转基因小鼠。

Ad LacZ对肿瘤感染效率的实验研究

基于腺病毒的靶向基因治疗是肿瘤生物治疗方式之一.为了更好的了解腺病毒靶向药物在裸鼠实体瘤中的运作效果,本研究中利用重组腺病毒报告载体Ad LacZ分别转染人肿瘤细胞系和裸鼠实体瘤,结合X-gal染色和组织切片的方法观察腺病毒载体在实体瘤原位转染后的运作模式,为实体瘤实验提供更多的经验借鉴和实验基础.

β-半乳糖苷酶基因在正常人及白血病人骨髓细胞的表达

为探索组织化学方法检测标志基因在正常骨髓细胞及白血病细胞的表达，本研究利用脂质体介导将ＮｅｏＲ基因和ＬａｃＺ基因共转移正常人及白血病人骨髓细胞。然后，采用Ｘ－ｇａｌ染色的方法，我们观察了ＬａｃＺ基因在转导细胞的表达。结果显示：ＬａｃＺ基因在正常人及白血病人骨髓细胞表达的阳性率分别为１３．３３％±２．６８％和１５．３９±３．６９％。经Ｇ４１８筛选后，转导阳性细胞率达到４６．０６％±３．４７％和４８．２２％±４．４７％。提示：经脂质体介导ＬａｃＺ基因在正常骨髓细胞及白血病细胞可获得高效的转移率。同时表明，利用组织化学方法可有效地检测标志基因的表达。

β-半乳糖苷酶在ROSAβgeo26小鼠衍生的神经干细胞中的表达变化

目的观察β-半乳糖苷酶(β-gal)在ROSAβgeo26小鼠衍生的神经干细胞(NSCs)中的表达变化。方法体外培养NSCs,并应用X-Gal组织化学和免疫细胞化学染色技术研究NSCs中β-gal的表达变化。结果原代克隆球和亚克隆球的NSCs均稳定表达β-gal;在NSCs分化过程中,NeuN阳性的神经元、GalC阳性的少突胶质细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞均表达β-gal,但表达水平有所下降。结论ROSAβgeo26小鼠衍生的NSCs能稳定的表达β-gal,可用作NSCs研究的细胞来源。但在干细胞分化的相关研究中,值得注意存在β-gal不同程度的表达下调现象,并应进一步关注出现该现象的潜在机制。

探索1种地表水中粪大肠菌群测定的方法

通过实验探索出1种在EC肉汤培养基中添加X-gal溶液和IPTG溶液的直接培养法,测定地表水中粪大肠菌群。该方法操作简单,检测时间较短,能满足日常实际工作中地表水粪大肠菌群的测定要求。