动物性别控制技术研究进展

性别控制是通过人为干预使雌性动物生产出特定性别后代的一项技术。鉴于X精子和Y精子的分离是实现动物性别控制的技术基础,本文基于X精子和Y精子在物理和化学上的特性差异总结和比较了受精前分离精子的新技术,包括流式细胞分离法、免疫学分离法、pH分离法、微流体和纳米技术。免疫学分离法中R848(雷西莫特)激活TLR7/8信号通路是精子分离的潜在方法,旨在为动物性别控制技术提供理论依据。

绵、山羊性控精液的制作技术与应用研究进展

绵、山羊性控精液的生产与应用大大提高了群体扩繁的效率,推动了羊产业快速发展。自性控精液技术发展以来,研究者们虽取得了一定的科研成果,但在羊生产中的应用仍然十分有限。本文系统综述了羊性控精液分离技术的发展及不同因素(包括品种、个体差异、稀释液配方、冷冻程序、饲养管理)对绵、山羊性控精液制作的影响,并阐述了羊性控精液的推广应用及前景展望,为绵、山羊性控精液高效分选、输精技术的研发及推广应用提供参考。

不同酸碱性稀释液联合一水肌酸对猪X、Y精子分离效果的研究

旨在探究调整猪精液稀释液酸碱性联合一水肌酸(ceatine monohydrate,CMH)对猪X、Y精子的分离效果。本研究使用8头2~4岁健康的杜洛克公猪采集精液,通过调整精液稀释液Beltsville(BTS)的pH,使用精子计算机辅助分析系统(CASA)检测精子活率和运动轨迹确定X、Y精子分选体系最适pH,利用CASA检测精子运动性能确定一水肌酸最适添加浓度。通过免疫荧光染色和流式细胞术评估X、Y精子分选效果,利用荧光标记法、精子活性氧MitoSOX Red染色等方法检测精子顶体、质膜完整性、活性氧含量等精子质量指标。结果表明,当稀释液pH为6.4和7.1时,孵育60 min对精子活率无显著影响(P>0.05),上层精子前向性运动占比极显著高于下层(P<0.01)。稀释液中添加750μmol·L^(-1)一水肌酸孵育60 min时显著提高了精子活力、直线运动速率、曲线运动速率和摆动性(P<0.05)。使用酸性稀释液联合一水肌酸分选猪X、Y精子,分选后上层精液X精子占比达63.32%;碱性稀释液联合一水肌酸分选猪X、Y精子,分选后上层精液Y精子占比达到67.19%。进一步研究发现,分选后顶体完整性、质膜完整性和ROS水平同对照组相比无显著差异(P>0.05),ATP水平、线粒体膜电位和运动性能显著高于对照组(P<0.05)。综上,本研究通过调整稀释液酸碱性并联合一水肌酸建立了一种简便、价廉和快捷的猪X、Y精子分选体系,该方法不影响分选后精子质量并提高精子运动性能,进一步为猪性控精液新技术研发提供试验依据。

癌-睾丸抗原SPANXB在肝癌中的表达及其影响肝癌进展的机制研究

目的·分析癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)家族成员SPANXB(sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome B)在肝癌中的表达及其与肝癌患者预后之间的相关性,并探究SPANXB对肝癌细胞增殖的影响及其潜在机制。方法·利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的肝癌样本数据,分析SPANXB在肝癌组织中的表达及其与患者生存期的相关性。构建稳定敲低SPANXB与稳定过表达SPANXB的肝癌细胞系,利用活细胞成像实验、EdU细胞增殖实验和平板克隆形成实验评估SPANXB对肝癌细胞增殖的影响。通过RNA测序(RNA-sequence,RNA-seq)探究SPANXB调控肝癌细胞增殖的相关通路,并利用细胞周期实验验证SPANXB对肝癌细胞周期的影响。采用免疫沉淀-质谱联用技术(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MS)探索与SPANXB相互作用的蛋白,并使用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)进行验证。结果·SPANXB mRNA在肝癌组织中的表达高于正常组织(P=0.003),且与肝癌患者的生存期呈负相关。稳定敲低SPANXB可降低肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力,而稳定过表达SPANXB则可促进这些过程。RNA-seq的结果显示,SPANXB的敲低可下调DNA复制与G1/S细胞周期转换相关通路,细胞周期实验的结果显示SPANXB的敲低可导致肝癌细胞周期发生改变。IP-MS和Co-IP结果显示,SPAXNB与有丝分裂停滞缺陷2样蛋白1(mitotic arrest deficient 2-like protein 1,MAD2L1)、WD重复域蛋白5(WD repeat domain 5,WDR5)等细胞周期相关蛋白存在相互作用。结论·SPANXB的高表达与肝癌的预后呈负相关,其可能通过与MAD2L1、WDR5相互作用调控细胞周期并增强肝癌细胞的增殖活性。

维生素C对荷斯坦公牛X精子冻后品质的影响

试验旨在研究维生素C(VC)对荷斯坦公牛性控精液冻后品质的的影响。在精液稀释液中分别添加0,2.0,4.0,6.0,8.0 mg/mL的VC进行试验。将装有X精子的细管冻精解冻(37.5℃,30 s)后分析0～3 h精子活率及0～4 h质膜完整率和顶体完整率的变化情况。结果表明,当添加量为6.0 mg/mL时,解冻后0 h精子活率与对照无差异显著,解冻后1、23、h精子活率与对照组差异显著(P<0.05)。当VC的添加量为4.0 mg/mL时,解冻后0 h时X精子质膜完整率显著高于对照组(P<0.05),解冻后1 h与对照相比差异不显著(P>0.05),但数值依然高于对照组。解冻后存放2、34、h与对照组相比差异显著。添加量为6.0 mg/mL时,解冻后0 h时X精子顶体完整率显著高于对照组(P<0.05),解冻后1、3 h精子顶体完整率与对照组相比差异显著(P<0.05),24、h与对照相比差异不显著(P>0.05),但顶体完整率高于对照组。在冷冻精液稀释液中VC的适宜添加量为4～6 mg/mL,此浓度下可有效提高荷斯坦公牛X精子解冻后活率、质膜完整率及顶体完整率。

奶牛X性控冻精应用研究

利用SX—MOFLO精子分离设备分离奶牛XY精子，将分离后的奶牛X精子冷冻保存。探讨奶牛X性控冻精解冻后存活时间、不同方法进行人工授精的受胎率，为奶牛X性控冻精的大规模推广应用提供依据。方法与结果：（1）取不同种公牛、不同批次的X性控冻精及普通冻精解冻后倒人5ml。试管内摇匀，至37℃水浴锅中，每2h检测一次精子活力，4h后每小时检测一次精子活力，直至无运动精子。结果奶牛X性控冻精存活时间为5～12h，比同种普通精于的存活时间短2～10h。（2）应用奶牛X性控冻精人工授精的母牛的情期受胎率（59．4％=342／576）与普通冻精的情期受胎率（60．6％=129／213）相比，无显著差异（P〉0．05）。奶牛X性控冻精母犊出生准确率93．3％（319／342），极显著地高于普通冻精48．8％（63／129）的母犊率（P〈0．001）。且应用奶牛X性控冻精人工授精后的青年牛的情期受胎率（65．6％=240／366）极显著的高于经产牛的情期受胎率（48．6％=102／210）（P〈0．001）。（3）在母牛发情结束后6～8h左右进行人工授精，其情期受胎率为67．1％（116／173），显著地高于在母牛发情开始后8～12h进行人工授精56．1％（226／403）的情期受胎率（P〈0．01）。（4）在准确判断母牛卵巢上卵泡发育状态的前提下，将精液全部输至发育侧子宫角大弯处，其情期受胎率62．7％（289／461），高于母牛每侧子宫角输1／2支X性控冻精46．1％（53／115）的情期受胎率，但二者之间差异不显著（P〈0．05）。研究结果表明应用奶牛X性控冻精进行人工授精，其受胎率与奶牛的经产与否、授精时间和输精部位有关。

45,X/46,XY混合性性腺发育不全患者采用卵母细胞捐赠获得活产1例及文献复习

目的:探讨45,X/46,XY混合性性腺发育不全的病因、诊断、治疗、受孕及分娩的临床特点,提高对此类患者的诊治及妊娠管理水平。方法:回顾性分析1例45,X/46,XY混合性性腺发育不全妊娠患者的临床资料并结合相关文献进行讨论。结果:通过患者第二性征发育不全、条索状性腺、染色体核型与社会性别不符等临床特征,结合性腺组织染色体畸变检测结果,确诊患者为45,X/46,XY混合性性腺发育不全,并给予“卵母细胞捐赠ICSI-ET治疗”获得活产。结合文献分析总结此类患者妊娠受孕、妊娠及分娩过程中的临床特点。结论:45,X/46,XY混合性性腺发育不全女性患者无生育能力,可通过卵母细胞捐赠获得妊娠,但此类孕妇的妊娠并发症的发病率以及异常分娩率均高于普通人群。明确诊断,加强妊娠风险评估,以改善围产结局。

镉对大鼠睾丸毒作用的酶学研究

为研究镉对睾丸的生化毒作用机理 ,应用氯化镉对成年雄性SD大鼠进行腹腔染毒 ,染毒剂量分别为 0 2、0 4和0 8mg/kg体重。连续染毒 7天后将动物处死 ,测定睾丸中各种酶的活性 ,同时进行睾丸精子头计数并计算每日精子生成量。结果显示 ,中剂量组碱性磷酸酶 (ALP)和乳酸脱氢酶同工酶 X(LDH X)活性即有显著降低 ,高剂量组降低更明显。而其它一些酶的活性如酸性磷酸酶 (ACP)、乳酸脱氢酶同工酶(LDH)、葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 (G 6PD)、山梨醇脱氢酶 (SDH)等及睾丸精子头计数和每日精子生成量仅在高剂量组出现明显降低。因此镉的雄性生殖毒性机理与酶的活性间存在一定关系。ALP和LDH X可作为反映镉雄性生殖毒性较敏感的生化指标。

利用性控精液体外生产奶牛早期胚胎

实验进行了精子处理方法、洗精液中添加抗生素种类及浓度、常规培养小滴(50μL)中入胚数的筛选,按照不同荷斯坦公牛个体分选的性控精液对体外生产的牛早期胚胎发育潜力的影响。结果表明:离心法处理性控精液效果最优。利用经过分选的性控精液进行体外受精(IVF)后都较易导致污染,且受精后的体外胚胎发育效果都较差。在洗精液中添加10μL/mL头孢哌酮钠的IVF胚胎体外发育较好,囊胚率达到16.9%;且在常规培养小滴中适当减少入胚数,能有效抑制利用性控精液制备的奶牛IVF胚胎自身对培养微滴的污染。利用直接离心法处理精液,在洗精液中添加头孢哌酮钠10μL/mL,可以成功进行牛性控精子的体外受精,但目前的受精效果低于用普通精子的体外受精效果。

奶牛体内性控胚胎生产的研究

为探讨奶牛合理的超排方法,采用分离的X冻精对17头超数排卵的荷斯坦奶牛进行人工授精,生产体内性控胚胎。结果表明,处理Ⅰ组在头均获卵数、可用胚及退化胚几个方面都低于处理Ⅱ组,但差异不显著(P>0.05);头均黄体数和未受精数,Ⅰ组高于Ⅱ组(P>0.05);青年牛头均获卵数、可用胚和退化胚方面都高于经产牛组,但差异不显著(P>0.05);青年牛头均未受精卵数显著高于经产牛(P<0.05),头均黄体数低于经产牛,但差异不显著(P>0.05)。

S-HPM辐射致牛X,Y精子的损伤差异研究

目的探讨S-HPM辐射致X、Y精子的损伤及其差异。方法经流式分选得到高纯度的牛X、Y精子,经30 mW/cm2和100 mW/cm2的S-HPM辐射4 min,通过精子动态分析系统检测辐射后1 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h的X精子和Y精子的活动度的差别;吖啶橙/溴化乙啶(acridine orange/ethidium bromide,AO/EB)染色检测辐射后1 h、6 h、12 h和24 h的X精子和Y精子凋亡率的变化。透射电镜观察100 mW/cm2S-HPM辐射后4 h X、Y精子超微结构损伤程度的差异。顶体酸性磷酸酶染色检测辐射后1 h、6 h和12 h顶体功能的变化差异。结果经30 mW/cm2和100 mW/cm2的S-HPM辐射后,精子活动度均随时间延长呈降低趋势,X、Y精子活动度的降低未见显著性差别(P>0.05)。S-HPM辐射可致X、Y精子凋亡率增加,呈现Y精子重于X精子,100 mW/cm2重于30 mW/cm2的趋势,其中早期具有显著性差异(P<0.05)。超微结构显示S-HPM辐射后精子以头部病变为主,尾部病变不明显,Y精子损伤重于X精子。S-HPM辐射后精子顶体酸性磷酸酶含量降低,Y精子重于X精子,100 mW/cm2重于30 mW/cm2(P<0.05,P<0.01)。结论 S-HPM辐射后X、Y精子均发生损伤,以精子头部病变为主,精子顶体酸性磷酸酶含量降低,Y精子的损伤重于X精子。

精子研究的有力工具——软X射线显微术

软X射线显微术是利用软X射线作为光源的显微成像技术 ,填补了光学和电子显微学之间的空白。与可见光显微镜相比 ,软X射线显微镜具有更高的成像分辨率 ;与电子显微镜相比 ,它具有的优势是能对较厚 (生物样品厚度可达 10 μm)、含水的自然状态下的样品直接成像 ,而无须对样品进行脱水、超薄切片和染色等处理。另外 ,软X射线显微术还可以用于生物样品内的元素分布和蛋白质、DNA等生物大分子的分析研究。本文简要介绍了软X射线显微术在生物学研究中的优势 ;

水牛精液中X和Y精子比率的鉴定

利用流式细胞仪分析水牛分离和未分离精液中精子的DNA含量,所得的直方图用高斯曲线拟合,分析计算出样本中X和Y精子的比率。结果表明:未分离的水牛精液中X精子的比率为50%,与正常水牛后代性别比率没有显著差异;而水牛的分离X精液样本中X精子占93%,分离Y精液样本中Y精子占89%。实验结果显示了流式细胞仪DNA分析法鉴定水牛精液中X和Y精子比率的可靠性,而流式细胞仪分离精子程序和方法在水牛上的应用是可靠而有效的。

应用X精子冷冻精液生产体内性控胚胎的试验

采用CIDR+FSH+PG法对206头优秀荷斯坦供体母牛进行超数排卵,其中实验组73头超排后用X性控冷冻精液输精(每头3支),获可用胚310枚,头均可用胚4.25枚;对照组133头,采用常规冷冻精液输精(每头3支),获得可用胚787枚,头均可用胚5.92枚,差异不显著。结果表明,用已分离的X精子冷冻精液对超排母牛进行人工授精生产体内性控胚胎是可行的。

奶牛性控冻精不同胎次受胎率的试验研究

为研究性控冻精对不同胎次奶牛受胎率的影响,试验选取了864头育成牛和84头2~5胎次的成年母牛并对其人工受精。结果表明,育成牛的情期受胎率较二胎、三胎、四胎、五胎以上和成年牛平均值分别高3.56%、6.69%、8.35%、5.18%和6.95%（P〈0.05）,即育成奶牛的情期受胎率显著高于二胎以上成年牛;育成奶牛与二胎以上成年奶牛的产母犊率相差1.19%,差异不显著（P〉0.05）。

X射线辐照引起GC1小鼠精原细胞凋亡诱导因子核转位并诱导其凋亡

目的研究X射线辐照后GC1小鼠精原细胞凋亡诱导因子(AIF)细胞定位的变化。方法 GC1细胞分别给予0、3、6、9 Gy X射线辐照,溴脱氧尿苷(Brd U)掺入实验检测辐照对细胞增殖速率的影响;辐照后48 h,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞核凝集情况,免疫荧光细胞化学染色检测胞质及胞核中AIF蛋白定位的变化,Western blot法分析细胞总蛋白、胞质蛋白及核提取物中AIF蛋白的水平。结果随着辐照剂量的增加,GC1细胞增殖速率显著减慢,细胞活性降低。6 Gy X射线辐照后全细胞提取物中AIF蛋白总量变化不大,但细胞核提取物中AIF显著增多,即AIF出现核转位的现象。结论 X射线辐照能够诱导小鼠精原细胞发生凋亡,该过程中伴有AIF入核的现象。

家畜性别决定的机制及其控制的研究进展

家畜性别决定的分子机理以及通过实施精子分离和早期胚胎性别鉴定来进行性别控制的研究进展

哺乳动物性控DNA疫苗研究现状和构想

介绍了DNA疫苗的定义、组成、机理、应用策略,综述了X、Y精子间蛋白和mRNA的研究现状,指出X、Y精子间基因表达差异的存在,利用mRNA差异显示技术可对X、Y精子构建性别差异表达的消减cDNA文库,大规模筛选性别差异表达基因,在此基础上应用DNA疫苗技术,既避开蛋白质水平寻找X、Y精子弱差异蛋白这个困难,又能够特异性地抑制X或Y精子,更经济地实现对性别的控制。性控DNA疫苗是新的研究方向。

不同剂量X射线对人外周血有核细胞DNA及精子DNA损伤的比较

目的:应用单细胞凝胶电泳技术检测不同剂量X射线对人离体外周血有核细胞DNA及精子DNA的损伤,评估外周血有核细胞及精子在高剂量X射线照射后DNA的损伤程度。方法:采用血常规正常的人外周血和采集精液常规正常的人精液,用能量为6MV的X射线给予0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy,10Gy的剂量照射。照射后1h内进行单细胞凝胶电泳检测人离体外周血中有核细胞和人离体精液中精子的彗星率、慧尾长度和尾巴DNA含量。结果:0Gy对照组人离体外周血中有核细胞的彗星率和离体精液中精子的彗星率分别是1.00%±0.10%2、.1%±1.5%,有统计学差异(υ=18t,=2.31>1.734,P<0.05);2Gy组人离体外周血中有核细胞的彗星率和精液中精子的彗星率分别是27.10%±4.71%、47.37%±8.32%,有统计学差异(υ=18t,=6.76>1.734,P<0.05);4Gy组人离体外周血中有核细胞的彗星率和精液中精子的彗星率分别是76.32%±10.28%、92.22%±9.02%,有统计学差异(υ=18t,=3.68<1.734,P<0.05);6Gy组人离体外周血中有核细胞的彗星率和精液中精子的彗星率分别是94.36%±3.24%1、00%有统计学差异(υ=18t,=5.508>1.734,P<0.05);8Gy1、0Gy组人离体外周血中有核细胞的彗星率和精液中精子的彗星率都分别是100%1、00%无统计学差异。结论:实验足以佐证在一定剂量范围内(2～6Gy)精子彗星实验比人离体外周血中单个核细胞彗星实验能更敏感的反映X射线对人体的损伤。

乳牛精子细胞核的两性分离试验

由于雄性配子（精子）有性染色体的差异，哺乳动物Ｘ、Ｙ精子在质量或密度上存在着微小的差别。为了突出这微小的质量差，实验先将两性精子共有的顶体和尾部都去掉，然后再将精子细胞核在氯化铯密度梯度条件下离心，成功地将乳牛精子细胞核分成明显的两个区带。