HSF1与XAF1基因在胃肠肿瘤中表达的研究

目的已知X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)相关因子1(XAF1)在胃肠癌细胞中低表达,本研究的目的在于探讨XAF1与热休克转录因子1(HSF1)在胃肠癌中的表达情况及其相互关系。方法应用免疫印迹分析法检测胃癌、大肠癌组织以及胃肠道肿瘤细胞株中的XAF1及HSF1蛋白表达;用含有HSF1的真核表达载体转染胃肠道肿瘤细胞株或用RNA干扰的方法上调或下调HSF1表达,同步检测对XAF1表达的影响;用应激原刺激诱导HSF1表达,观察对XAF1表达的作用。结果在胃肠癌组织中HSF1的表达高于正常组织;在胃肠癌细胞株中XAF1与HSF1的表达呈负相关,应激刺激上调HSF1的同时下调XAF1表达。结论胃肠道肿瘤细胞高表达HSF1,其结果是抑制XAF1表达,这种机制应该是XAF1在(胃肠道)肿瘤细胞中低表达并导致肿瘤细胞凋亡缺失的原因之一。

XAF1在结直肠腺瘤中的表达及其意义

目的检测抑癌基因XAF1在结直肠腺瘤中的表达情况,初步探讨其在结直肠腺瘤发生发展中的作用。方法半定量RT-PCR方法检测71例结直肠腺瘤性息肉、9例增生性息肉及25例正常黏膜组织中XAF1的表达情况,免疫组织化学方法检测51例结直肠腺瘤性息肉、24例增生性息肉及36例正常黏膜组织中XAF1的表达情况。结果XAF1mRNA在结直肠腺瘤性息肉、增生性息肉及正常黏膜组织中均表达,其相对表达强度分别为0.65±0.39、0.67±0.23、0.67±0.31,腺瘤中表达偏低,但差异无显著性(F=0.035,P=0.966)。XAF1蛋白在结直肠正常黏膜及增生性息肉中主要表达于细胞核,胞浆也有表达;在腺瘤中细胞核表达减少(P<0.05),而细胞浆表达相对增多(P<0.05),总体表达强度降低(P<0.05)。结论XAF1蛋白在结直肠腺瘤中存在表达降低和胞浆异位表达,XAF1基因在结直肠腺瘤的发生及向腺癌的演变中可能起抑癌基因的作用。

XAF1转录变异体在胃肠道肿瘤细胞株中的表达及意义

目的探讨XAF1不同转录变异体在胃肠道肿瘤中的表达情况及在肿瘤中的可能作用。方法培养18株肿瘤细胞及正常转化细胞,取正常人胃黏膜组织及外周血淋巴细胞作为对照,RT-PCR方法检测XAF1 3种不同转录变异体的的表达情况;用人重组IFN-α作用于MGC803细胞24 h后,RT-PCR方法检测XAF1 3种不同转录变异体的改变情况。结果 XAF1A及XAF1B在胃肠道肿瘤细胞株及正常转化细胞中多不表达或低表达,高表达XAF1A的肿瘤细胞株(KATOⅢ、COLO205、HCT116、ESO)同时表达XAF1C,IFN-α能同时上调XAF1的不同转录变异体。结论 XAF1C与XAF1A、XAF1B在细胞凋亡上可能起相互拮抗作用,XAF1C的高表达可能与肿瘤细胞的转移有关。与XAF1A一样,XAF1B、XAF1C也可被干扰素诱导。

非小细胞肺癌患者中XAF1的表达及其临床意义

目的研究非小细胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)患者中XAF1基因的mRNA水平,并分析与NSCLC临床病理特征的关系。方法采用Real-PCR检测60例NSCLC患者癌组织标本和配对正常癌旁组织的XAF1基因mRNA表达水平,比较癌组织和癌旁组织XAF1基因的表达差异;采用单因素方差分析不同临床病理特征间XAF1基因的表达差异。结果 NSCLC患者癌组织XAF1基因的mRNA水平明显低于正常癌旁组织XAF1基因的表达量,且XAF1基因的mRNA水平随着分化程度降低、TNM分期增加及淋巴结转移而降低;差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 XAF1基因在NSCLC患者中呈低水平表达,其表达水平的降低可能与促进NSCLC的发生、发展有关。

人XAF1基因启动子的克隆及其在人肝癌细胞株中活性的测定

目的分析XAF1基因启动子在肝癌细胞株中的活性,为研究XAF1基因转录调控的基本机制奠定基础。方法从肝癌细胞株中扩增XAF1基因的1 395 bp启动区域片段并分别克隆到报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1中,分别将含有XAF1基因启动子的报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721,检测萤火虫荧光素酶的活性并观察绿色荧光蛋白的表达。通过转染细胞、荧光素酶活性测定及观察绿色荧光蛋白的表达,检测其启动子活性。结果重组的质粒经双酶切和测序结果证实克隆的XAF1启动子片段序列正确;转染后的HepG2、SMMC7721荧光素酶相对发光强度分别是6.97±0.74、6.12±0.59。其绿色荧光蛋白强度明显低于对照组。结论本实验构建的含XAF1启动子的报告基因质粒为研究XAF1基因的转录调控提供实验依据。

稳定过表达XAF1基因对A2780卵巢癌细胞生物学功能的影响

目的构建稳定过表达XAF1基因A2780卵巢癌细胞株,并观察XAF1基因对卵巢癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及对紫杉醇敏感性的影响。方法分别将质粒pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-XAF1转染至卵巢癌细胞A2780,通过质粒抗性标记(遗传霉素G418)筛选得到阴性对照细胞株(A2780/Negative control,A2780/NC)和稳定表达XAF1的细胞株(A2780/XAF1);通过行细胞克隆形成实验和CCK8实验检测细胞增殖及对紫杉醇的敏感性,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡。结果成功构建了稳定表达XAF1的卵巢癌细胞A2780/XAF1,细胞形态无明显变化;与A2780/NC相比,A2780/XAF1克隆形成能力能力更低(P=0.0016),细胞贴壁后第1天和第3天增殖活性更低(P=0.009,0.0035),两组细胞的细胞周期分布差异存在统计学意义(P<0.0001),两两比较结果显示A2780/XAF1组G2-M期细胞百分比显著增加(P<0.001)。在无凋亡刺激、无血清培养及紫杉醇诱导下,A2780/XAF1的凋亡率均比A2780/NC更高(P<0.001);在不同紫杉醇浓度作用下,A2780/XAF1的增殖活性均显著低于A2780/NC(P<0.001),且A2780/XAF1的紫杉醇半数抑制浓度显著低于A2780/NC。结论成功构建稳定表达XAF1的卵巢癌细胞A2780/XAF1;XAF1调控卵巢癌细胞A2780的增殖、凋亡及细胞周期,并增加了卵巢癌对紫杉醇的敏感性。

抑癌基因XAF1和BNIP3表达及其异常甲基化与宫颈病变相关性研究

目的探讨抑癌基因XAF1和BNIP3表达及其异常甲基化与宫颈病变的关系。方法选择140例手术切除并经病理证实的标本,其中宫颈癌组48例,宫颈上皮内瘤样病变2~3级组织(CIN2-3组)32例,宫颈皮内瘤样病变1级组织(CIN1组)30例,正常宫颈组织(对照组)30例,采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)法及免疫组化(SP)法,检测上述各组中XAF1和BNIP3启动子区甲基化状态及蛋白表达水平。结果正常宫颈组、CIN1组、CIN2-3组、宫颈癌组XAF1基因启动子甲基化阳性率分别为3.3%、6.6%、37.5%、60.4%,正常宫颈组与CIN1组甲基化阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);CIN1组与CIN2-3及宫颈癌组甲基化阳性率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);正常宫颈组、CIN1组、CIN2-3组、宫颈癌组BNIP3基因甲基化阳性率分别为16.7%、20.0%、43.8%、68.8%,正常宫颈组与CIN1组甲基化阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);CIN1组与CIN2-3及宫颈癌组甲基化阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05);正常宫颈组、CIN1组、CIN2-3组、宫颈癌组XAF1蛋白的阳性表达率分别为73.3%、76.7%、40.6%、10.4%,宫颈组与CIN1组XAF1蛋白表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05);CIN2-3组及宫颈癌组XAF1蛋白表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);正常宫颈组、CIN1组、CIN2-3组、宫颈癌组的BNIP3蛋白表达率分别为63.3%、70.0%、43.8%、14.6%,正常宫颈组与CIN1组BNIP3蛋白表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05);CIN1组与CIN2-3组、宫颈癌组比较,BNIP3蛋白表达率逐渐下降,差异均有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组织中XAF1蛋白与BNIP3蛋白表达呈正相关(P<0.05)。结论XAF1及BNIP3基因启动子甲基化所致的XAF1及BNIP3表达失活,可能在宫颈病变的发生及发展过程中起着重要作用。

5-氮杂胞苷对骨髓瘤细胞增殖抑制作用及对XAF1基因表达的影响

目的探讨5-氮杂胞苷处理对骨髓瘤细胞系RPMI 8226和XG-7细胞中XAF1基因表达的影响及体外抗骨髓瘤作用的机制。方法采用逆转录PCR和Western blot方法检测骨髓瘤细胞系RPMI 8226和XG-7细胞中XAF1基因和蛋白的表达。采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测XAF1基因启动子CpG岛甲基化状态。采用0～5μmol／L 5-氮杂胞苷处理骨髓瘤细胞株。采用CCK-8比色法检测5-氮杂胞苷处理对骨髓瘤细胞增殖抑制作用。采用Annexin V／7-AAD染色流式细胞术检测细胞凋亡。结果XG-7细胞不表达XAF1 mRNA及蛋白，RPMI 8226细胞表达XAF1 mRNA转录本1和2。XG-7和RPMI 8226细胞XAF1基因启动子CpG岛均存在过甲基化。XG-7和RPMI 8226细胞经2．5μmol／L 5-氮杂胞苷处理72h后仅表达XAF1 mRNA转录本1并表达XAF1蛋白，并且XAF1基因启动子CpG岛甲基化程度降低。5-氮杂胞苷抗骨髓瘤作用呈时间和浓度依赖性。5-氮杂胞苷处理RPMI 8226和XG-7细胞48h的，氏值分别为2．4μmol／L和2．6μmol／L。结论骨髓瘤细胞中抑癌基因XAF1表达缺失或表达异常与XAF1基因启动子CpG岛过甲基化有关。5-氮杂胞苷处理可以诱导XAF1 mRNA及蛋白表达。5-氮杂胞苷在临床上能达到的药物浓度下具有抗骨髓瘤作用，其作用机制是诱导骨髓瘤细胞凋亡。

XAF1基因诱导胰腺癌细胞株BxPC3凋亡的实验研究

目的探讨Ad5／F35腺病毒介导的XAF1基因诱导胰腺癌细胞BxPC3凋亡及其可能的作用机制。方法将前期构建的重组腺病毒Ad5／F35-XAF1感染胰腺癌细胞BxPC3。采用半定量RT-PCR、蛋白质印迹检测法检测感染前后BxPC3细胞XAFlmRNA和蛋白表达的变化；运用Annexin—V／PI和TUNEL法检测细胞的凋亡率；免疫蛋白印迹法检测细胞Caspase-3、PARP、Caspase-8和Bcl-2蛋白的表达。结果Ad5／F35-XAF1感染后，BxPC3细胞的XAFlmRNA和蛋白表达明显增高，与空白组和Ad5／F35-Null对照组比较，差异显著（P〈0．05）；两种方法检测的细胞凋亡率分别为（19．90±3．09）％、（9．29±2．13）％，较A（15／F35-Null组的（6，72±0．76）％、（2．73±0．51）％和空白组的（7．22±1．53）％、（1．56±0．47）％均有显著差异（P〈0．01）；Caspase-3、PARP、Caspase-8蛋白表达显著增强，Bcl-2表达降低。结论Ad5F35-XAF1重组腺病毒感染胰腺癌细胞BxPC-3能明显诱导细胞的凋亡，其机制可能是激活死亡受体途径和线粒体途径。

粪便DNA中X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子甲基化状态在结直肠癌筛查中的应用研究

目的以粪便DNA中x染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子（XAF）1基因启动子区域的甲基化状态为靶目标，建立新的有效的筛查结直肠癌的方法。方法收集需做肠镜检查患者自然排泄粪便，经肠镜或病理学检查确诊后，分为3组，结直肠正常组45例，结直肠腺瘤组30例，结直肠腺癌组24例。使用QIAampDNAStoolMiniKit自粪便抽提人DNA。应用甲基化特异性的PCR（MSP）检测粪便DNA中XAFl基因启动子区域甲基化状态。结果经genomic—DNAPCR，证实所提取DNA均含有人基因组DNA。经MSP检测，正常组存在高甲基化15例，阳性率33．33％；腺瘤组18例，阳性率60．00％；腺癌组15例，阳性率62．50％，腺瘤组、腺癌组与正常组比较差异有统计学意义（P〈0．05），但腺瘤组与腺癌组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论使用Qiagen试剂盒抽提粪便中人DNA的方法比较稳定。以粪便DNA中XAFl基因启动子区域甲基化状态为靶目标进行结直肠肿瘤的早期诊断，敏感度、特异度较高，但尚需要大样本研究进一步验证。