乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术筛选乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白 (HBxAg)反式激活基因 ,克隆HBxAg反式激活相关靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3 .1(-) X转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与PGEM Teasy载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析 ,发现其中之一为未知基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对 ,电子拼接成功 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷信号序列 ,初步确定新型基因序列。从转染了pcDNA3 .1(-) X的HepG2细胞提取总RNA ,以RT PCR技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序加以证实。结果 发现的新基因命名为XTP3 ,在GenBank中注册 ,注册号为AF490 2 5 2。XTP3基因的编码序列全长为 10 2 0个核苷酸(nt) ,编码产物由 3 40个氨基酸残基 (aa)组成。结论 应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆HBxAg反式激活新型靶基因XTP3 。

应用抑制性消减杂交技术筛选XTP3的反式激活基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库 ,克隆XTP3反式激活相关基因。方法 以XTP3表达质粒pcDNA3 1(- ) XTP3转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 30个白色克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 2 3个 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。对所得片段测序 ,并进行同源性分析 ,共得到 2 0种已知基因序列和 2种未知功能基因序列 ,可能是XTP3反式激活靶基因。结论 成功构建了乙型肝炎病毒XTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础。

基因表达谱芯片技术筛选XTP1基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术 ,检测乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白 (HBxAg)反式激活基因XTP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响 ,进一步阐明XTP1蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP1基因序列特异性的引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增XTP1基因片段 ,以常规的分子生物学技术将获得的XTP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 1(-)_XTP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空表达载体pcDNA3 1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定 ,证实准确无误。提取高质量的mRNA ,逆转录为cDNA ,进行cDNA芯片分析。在 115 2个基因表达谱的筛选中 ,发现有 3个基因表达水平显著上调 ,2 4个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP1转染细胞后差异表达基因 ,为进一步阐明XTP1蛋白可能的生物学功能提供依据。

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP8的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒 X 蛋白(HBxAg)反式激活基因差异表达的 cDNA,克隆 HBxAg 反式激活相关靶基因.方法:以 HBxAg 表达质粒 pcDNA3.1(-)-X 转染 HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取 mRNA 并逆转录为 cDNA,经 RsaI 酶切后,将实验组 cDNA 分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组 cDNA 进行两次消减杂交及两次抑制性 PCR,将产物与 T/A 载体连接,构建 cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆 PCR 扩增后进行测序及同源性分析,发现其中之一为未知基因片段,与GenBank 中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak 规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,初步确定新型基因序列.从转染了 pcDNA3.1(-)的 HepG2细胞提取总 RNA,以 RT-PCR 技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实.结果:发现新基因,命名为 XTP8,在 GenBank 中注册,注册号为 AF490257.XTP8基因的编码序列全长为1590个核苷酸(nt),编码产物由530个氨基酸残基(aa)组成.结论:应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆 HBxAg 反式激活新型靶基因 XTP8,为进一步阐明 HBxAg 反式调节作用及其在 HBV 感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.

基因表达谱芯片技术筛选XTP4基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP4的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP4蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP4基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP4基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP4编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP4。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有21个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP4转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP4蛋白可能的生物学功能提供依据。

新基因XTP11表达蛋白在酵母细胞中的转录激活功能研究

目的构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP11的酵母表达载体,探索应用酵母双杂交系统克隆与XTP11蛋白结合的肝细胞蛋白的可行性。方法用聚合酶链反应(PCR)扩增XTP11编码基因,并在其5′端引入NcoI/BamHI酶切位点,连接入酵母表达载体pGBKT7中,构建编码XTP11全序列与酵母蛋白GAL4DNA结合域融合蛋白的酵母表达质粒,转化酵母细胞AH109并应用Westernblot方法检测XTP11蛋白表达。然后铺于含有X-α半乳糖的SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade营养缺陷型培养基上进行自激活验证(蓝/白筛选)。结果成功地构建了XTP11的酵母表达载体并在酵母细胞中表达相应的融合蛋白,转化了pG-BKT7-XTP11的AH109酵母细胞在两种营养缺陷型培养基上均可正常生长,并且可以产生α-半乳糖苷酶,从而在铺有X-α半乳糖的培养基上呈现蓝色,表明XTP11蛋白代替了酵母GAL4蛋白的DNA激活域发挥作用,从而激活下游报告基因(ADE2,HIS3,MEL1和LacZ)的表达。结论全序列XTP11蛋白与GAL4DNA结合域的融合蛋白在酵母细胞中呈现转录激活功能,限制了应用酵母双杂交系统研究XTP11的肝细胞结合蛋白。

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP7的克隆

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病 X蛋白(HBxAg)反式激活基因差异表达的 cDNA,克隆 HBxAg反式激活相关靶基因.方法:以 HBxAg 表达质粒 pcDNA3.1(-)-X 转染 HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取 mRNA 并逆转录为 cDNA,经 RsaI 酶切后,将实验组 cDNA 分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组 cDNA 进行两次杂交消减及两次抑制性 PCR,将产物与 T/A 载体连接,构建 cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆 PCR 扩增后进行测序及同源性分析,发现其中之一为未知基因片段,与 GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的 Kozak 规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,初步确定新型基因序列.从转染了 pcDNA3.1(-)的 HepG2细胞提取总RNA,以 RT-PCR 技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实.结果:发现新基因,命名为 XTP7,在 GenBank 中注册,注册号为 AF490256.XTP7基因的编码序列全长为588个核苷酸(nt),编码产物由196个氨基酸残基(aa)组成.结论:应用 SSH 成功筛选与克隆 HBxAg 反式激活新型靶基因 XTP7,为进一步阐明 HBxAg 反式调节作用及其在 HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP12的克隆化

目的:应用基因表达谱芯片技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制. 方法:以HBV X蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取总RNA 进行逆转录,对产物行基因表达谱芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV X反式激活作用的新的靶基因. 结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被X蛋白反式激活,故命名为X蛋白反式激活蛋白12(XTPl2),已在GenBank中注册,注册号: AY598792.PS2TP1基因的编码序列全长为731个核苷酸(nt),编码产物由230个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HBV X反式激活新靶基因被成功克隆,为进一步研究HBV X蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

新基因XTP3反式激活基因TPA的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因。方法:依据我室构建的HBV X蛋白反式激活基因XTP3差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得新基因XTP3TPA的编码序列,对其可能的氨基酸序列进行分析比较,并对其进行克隆化研究。结果:发现了HBV XTP3反式激活作用的新的靶基因,命名为XTP3TPA。结论:这一发现为阐明HBV XTP3蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向。

基于XTP的卫星协议网关设计

随着卫星互联网络技术的发展,对卫星网络协议的研究受到越来越多的关注。卫星网络与地面有线网络具有不同的物理特性和信道特性,当TCP协议直接应用于卫星链路时,TCP协议的通信机制使得其信道吞吐量等性能受到很大的影响。XTP协议具有适合于卫星链路数据传输的通信机制,分析了XTP协议的传输机制,设计了基于XTP协议的卫星网关方案,并对方案采用的协议分段、协议欺骗、数据传送机制和开发平台进行了分析和描述。研发的原理样机在卫星信道上进行了测试,测试结果表明,采用该方案实现的协议网关可以提高信道带宽的利用率80%左右。

TCP和XTP协议传输性能仿真与分析

针对卫星链路的特点,利用仿真技术,采用NS2仿真软件建立仿真模型,设计仿真场景,给出了软件实现方法,分别在固定误码率和信道带宽、时延变化条件下,固定时延和信道带宽、误码率变化条件下,固定时延和误码率、信道带宽变化条件下,对TCP协议和XTP协议在卫星链路的传输性能进行了仿真和对比分析,最后得出结论,XTP协议的通信机制比TCP协议更适合于卫星链路数据传输,为基于XTP协议的卫星协议网关设计提供仿真依据。

XTP协议研究及其在Intranet中的应用

ＸＴＰ是新一代轻型运输层协议，研究如何利用ＸＴＰ现有的速率控制，根据接收方ＲＴＴ时间估计和分组丢失率估算，借助“ＴＣＰ友好”的速率计算近似公式和ＴＣＮＴＬ分组的速率协商过程，制定ＸＴＰ的拥挤控制．并讨论ＸＴＰ在企业Ｉｎｔｒａｎｅｔ中支持Ｗｅｂ应用和实时多媒体应用的方案．

在肝母细胞瘤中筛选XTP6的反式调节基因及其意义

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建XTP6反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选XTP6蛋白反式激活相关基因。方法:构建XTP6真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6,并将其转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;48h后收获细胞后提取mRNA并逆转录成cDNA,tester cDNA经RsaI酶切消化后分成两组,分别与两种不同接头衔接,再与过量的driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应,第二次PCR产物与pGEM-Teasy克隆载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果:成功构建人XTP6蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库。扩增后得到70个200-1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得11种已知功能编码基因。结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞周期调节、生物代谢和炎症修复密切相关的蛋白编码基因。

WinXTP:面向对象快捷运输协议的设计与实现

高速传输服务和新型网络应用对传统协议在功能和性能两个方面提出了新的挑战；协议机制的改进、实现的优化、设计和标准化新的协议是最可行的解决方案．快捷运输协议是集大成的轻型运输层协议，具有协议机制和控制策略分离的特色，在学术研究、标准化和商业应用等领域都有较大的影响．本文提出的面向对象的ＸＴＰ设计模型及在Ｗｉｎｄｏｗｓ环境的实现体现了ＸＴＰ内在的功能灵活和性能高效。

XTP3基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建稳定表达乙肝病毒XTP3蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导融合蛋白的表达,制备兔抗XTP3蛋白多克隆抗体并检测该抗体在乙肝肝癌、正常肝组织中的作用效果。方法PCR获得XTP3基因片段,插入至pET-32a(+)中构建原核表达载体pET-32a(+)-XTP3,测序正确后转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定融合蛋白的表达。利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blotting及免疫组化验证。结果成功构建pET-32a(+)-XTP3表达载体并在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的XTP3融合蛋白,目的蛋白分子量为52kD,SDS-PAGE分析表明为包涵体表达。经亲和树脂纯化后免疫新西兰兔,成功获得融合蛋白及兔抗XTP3多克隆抗体。ELISA检测证明多克隆抗体效价>1:128000。免疫组化证实本实验中XTP3多克隆抗体在肝癌组织中的表达呈明显的细胞膜阳性,特异性良好。结论成功表达、纯化了XTP3基因融合蛋白,获得高特异性、高效价兔抗XTP3多克隆抗体,为进一步研究XTP3蛋白的生物学特性奠定了基础。

基于XTP的ITER广域网链路优化方案研究

为了满足国际热核聚变实验堆(ITER)计划全球网络不断增长的性能需求,提出了一种结合高速协议和改进传输机制的广域网链路优化解决方案。通过分析和研究快速传输协议XTP,根据XTP提供的丰富功能接口,调整burst/rate模型有效避免拥塞产生,标记分组序号改进go-back-n重传机制,同时采用协议欺骗技术减少响应延迟,分析相关协议字段实施精确QoS策略,充分利用协议的特性对网络传输实现了灵活改进。测试结果表明该方案能够显著提高ITER中法国际链路的性能。

HBX蛋白反式激活基因XTP4抑制HepG2细胞凋亡

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBXAg)反式激活基因4(XTP4)对肝母细胞瘤细胞HepG2细胞凋亡的影响。方法构建XTP4基因的真核表达质粒pc DNA3.1/myc-His(-)A-XTP4(p XTP4)及化学合成XTP4基因的干扰RNA(si XTP4)后,分别将XTP4基因的真核表达质粒、干扰RNA及各自的阴性对照(NC、si NC)瞬时转染HepG2细胞中,48 h后进行以下实验:用Western blot验证XTP4在蛋白水平的过表达和干扰表达;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白水平并计算Bcl-2/Bax比值;化学发光法检测胱冬肽酶-3(caspase-3)的活性。结果成功构建了XTP4的真核表达质粒p XTP4、XTP4在蛋白水平过表达和干扰表达。与各自的阴性对照组相比,过表达XTP4的HepG2细胞中,Annexin V+细胞数显著减少(P<0.05),Bcl-2/Bax比值增高(P<0.05),胱冬肽酶-3活性下降(P<0.05);而干扰XTP4表达的HepG2细胞中,Annexin V+细胞数显著增加(P<0.05),Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05),胱冬肽酶-3活性上升(P<0.05)。结论 XTP4具有抑制HepG2细胞凋亡的作用,可能是通过增加Bcl-2/Bax的比值实现。

应用传输协议XTP对集群内部通信性能的改善

文中提出采用高效、灵活的XTP传输协议改进集群系统的内部通信性能。针对集群应用的通信特点,从理论上论述了XTP有效改善集群内部通信性能的协议机制。通过试验,在集群环境下实现用户层XTP,比较了XTP与传统通信协议的网络性能,并选取典型集群应用,比较了在XTP和传统通信协议下集群内部通信性能。实测数据表明,采用XTP在一定程度上改善了集群系统通信性能。

新基因XTP11剪切体的克隆与亚细胞定位

[目的]克隆乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白反式调节基因11(XTP11)的剪切体,观察剪切体蛋白在人肝癌细胞HepG2中的定位。[方法]利用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transciptase-polymerase chain re-action,RT-PCR)技术扩增XTP11剪切体,将目的基因片段插入克隆载体pGEM-T中,经双酶切和测序鉴定后,定向克隆至荧光表达载体pEGFP-C1中,转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察确定其亚细胞定位。[结果]XTP1剪切体的开放阅读框长度为1314 bp,编码产物为437个氨基酸残基;重组质粒在HepG2细胞中转染效率为50%,蛋白定位于细胞浆。[结论]转染重组表达载体的细胞内出现局限性强绿色荧光信号,推断目的蛋白位于细胞质内。XTP11剪切体的克隆和亚细胞定位为进一步从分子水平分析其生物学功能奠定基础,为阐明其在乙型肝炎病毒X蛋白致病机制中的作用提供信息。

乙型肝炎病毒反式激活因子XTP4促进肝癌细胞系迁移和侵袭

目的探讨在肝癌细胞系Hep G2中过表达或干扰XTP4表达对细胞迁移和侵袭能力的影响。方法实验分对照组、过表达组和干扰组,将构建成功的XTP4质粒和化学合成的XTP4小干扰RNA(siRNA)瞬时转染入Hep G2,培养48 h后,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和蛋白印迹(Western blot)检测细胞内XTP4 mRNA和蛋白表达; Snail和NF-κB以及上皮间质转化(EMT)相关分子的表达。并通过细胞划痕愈合实验、Transwell迁移侵袭实验观察细胞迁移侵袭能力。结果成功重培养并提取出XTP4质粒;过表达组XTP4的转录水平和翻译水平均明显高于对照组(P<0. 05);迁移和侵袭能力明显增加(P<0. 05);下游分子NF-κB、Snail和MMP-9表达均增加(P<0. 05);干扰组XTP4的转录水平和翻译水平较对照组均明显降低(P<0. 05);迁移和侵袭能力也明显降低(P<0. 05);NF-κB、Snail和MMP-9表达减少(P<0. 05)。结论乙型肝炎病毒反式激活因子XTP4可促进Hep G2迁移和侵袭,与NF-κB、Snail和MMP-9调节相关,EMT相关分子E-cadherin、N-cadherin可能参与其中。