表达乙肝病毒YVDD变异株肝癌细胞模型的建立

目的:建立能稳定表达乙肝病毒(HBV)YVDD变异株的细胞模型,为研究HBV YVDD变异株的生物学特性和进行抗病毒药物筛选提供细胞模型。方法:以pcDNA3·1-HBV-YVDD为模板设计两对引物,扩增带不同酶切位点的HBV全基因,扩增产物纯化后,经酶切、连接,得到pcDNA3·1-HBV-YVDD重组体。采用脂质体转染技术,将pcDNA3·1-HBV-YVDD重组体转染体外培养的HepG2细胞。细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的检测用酶联免疫吸附法(ELISA)法,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HBV多聚酶的表达。结果:建立了HBV-YVDD变异株体外感染的细胞模型HepG2-2HBV-YVDD。该细胞模型能表达较高水平的HBsAg和HBeAg,并能检测到多聚酶的表达。结论:成功构建了能较稳定表达HBV-YVDD变异株的细胞模型。

1.3倍体HBV YIDD变异株真核表达载体构建及鉴定

构建HBV YIDD拉米夫定耐药株1.3倍全基因真核表达载体,为进一步探讨乙肝病毒变异株的生物学特性及筛选抗病毒药物奠定基础。参考GenBank HBV序列设计并合成一系列引物,以临床证实为拉米夫定耐药的病人HBV DNA为模板,通过PCR扩增得到HBV全基因组并克隆至pGEM-T Easy载体中,经测序证实聚合酶基因存在YIDD变异,然后以该病人的HBV全基因组为模板构建1.3倍全基因HBV-YIDD变异真核表达载体pcDNA3.1(+)-1.3HBV。通过PCR扩增,酶切及测序证明pcDNA3.1(+)-1.3HBV表达载体构建成功,该表达载体的构建为后期建立稳定表达HBV-YIDD变异的细胞模型提供材料。

未予核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎病毒感染者YMDD变异及特点

目的探讨未予核苷(酸)类似物(NA)治疗乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者P基因YMDD基序变异对于血清肝脏生化指标的影响,及YMDD变异两种形式YIDD/YVDD与HBV e抗原(HBeAg)的关系。方法采用引物特异性实时荧光聚合酶链反应(PCR)法检测慢性HBV感染者外周血HBV P基因区YIDD/YVDD变异及HBVDNA载量,并检测HBeAg、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平。结果 334例未经NA抗病毒治疗的慢性HBV感染者中,HBV未变异300例,YVDD变异23例,YIDD变异9例,YIDD、YVDD共生株2例。慢性HBV感染者HBeAg阳性与YIDD变异有关(P<0.05),与YVDD变异无关(P>0.05)。YMDD变异者与未变异者AST、ALT水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而HBV DNA比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV感染者发生YIDD/YVDD变异者,其血清ALT、AST水平均低于未变异者。HBeAg阳性者可能更易发生HBV YIDD变异,而YVDD变异可能与HBeAg状态无关。

拉米夫定治疗前与治疗期间乙肝病毒YMDD变异研究

目的研究慢性乙型肝炎患者应用拉米夫定治疗前与治疗一年期间的乙肝病毒YMDD变异情况。方法103例接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者,在开始治疗前和治疗第1、4、8个月以及1年时采集患者外周血,提取乙型肝炎病毒DNA,采用单核苷酸多态性分析方法,进行短核苷酸片段测序分析。结果乙型肝炎病毒DNA多聚酶区,使用拉米夫定治疗前,发生YVDD变异者1例,发生YIDD变异者2例;治疗第1月,发生YVDD变异者2例,发生YIDD变异者2例;治疗第4月,发生YVDD变异者3例,发生YIDD变异者4例;治疗第8月,发生YVDD变异者6例,发生YIDD变异者8例;治疗1年时,发生YVDD变异者11例,发生YIDD变异者13例。结论在进行拉米夫定治疗前,乙型肝炎病毒即有变异情况发生,随拉米夫定治疗变异率增加治疗1年时,乙型肝炎病毒发生变异率最高。