拉米夫定治疗中国乙型肝炎患者中发现YMDD耐药变异株

为了监测拉米夫定临床治疗过程中耐药性的产生 ,更好地指导临床用药。采用 PCR产物克隆后测序的方法 ,对 2 0例服用拉米夫定病人进行随访观察 ,检测其体内乙型肝炎病毒 (HBV)聚合酶基因 (P gene) )酪氨酸 -蛋氨酸 -天门冬氨酸 -天门冬氨酸 (YMDD)区域变异情况 ,同时观察其 HBV DNA定量和肝功能指标变化。结果发现 ,1例病人在服用拉米夫定 9个月时出现 HBV YMDD变异株 ,并由混合感染逐渐进展为单一的变异株感染 ,出现耐药时伴有 HBV DNA定量反跳和 AL T的上升。表明拉米夫定长期治疗 (>6个月 )可能出现耐药 ,耐药变异株由弱势株逐渐演变为优势株 ,耐药出现时可伴有 HBV

HBV YMDD模序突变及其与肝癌发生的关系

目的探讨肝癌病人HBV YMDD模序突变及其与肝癌发生的关系。方法用流过式反向斑点杂交结合血清生化指标分析慢乙肝组(CHB)、肝硬化组(LC)和肝癌组(HCC)中HBV YMDD模序突变情况。结果HCC组、LC组、CHB组HBV YMDD模序突变率分别为1.67%(1/60)、4.44%(2/45)和63.82%(30/47)。HCC组、LC组及CHB组中ALT(谷丙转氨酶)活性分别为(66±25)、(66.98±113)、(105±170)U/L,而AST(谷草转氨酶)活性分别为(152±108)、(74.13±58)和(57.2±56.6)U/L。HBV YMDD模序突变的产生与用药时间长短显著相关,HBV YMDD模序突变与ALT升高相关性不显著,但与AST升高显著相关。60例肝癌中有HBVYMDD模序突变的只有1例,突变率为1.67%。结论HBV YMDD模序突变的发生与肝癌发生不存在明显相关性,仅与拉米夫定用药时间长短显著相关。同ALT相比,AST更好地反映了HBV引起的肝病肝脏损坏的严重程度。ALT是拉米夫定用药过程中与HBV YMDD突变有关的较为敏感的肝功能生化诊断和病情监测指标。

基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎后引起的HBV YMDD变异

目的 建立乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测诊断方法。方法 设计特异性寡核苷酸探针数组 ,特别处理芯片载体 ,用点样法制备乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片。选择 30例服用拉米夫定后 ,HBVDNA转阴 ( <5 0 0copies/ml) ,6 8周后又反跳≥ 5 0 0copies/ml的病人进行基因芯片杂交检测分析。同时用PCR直接测序法对病人血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。结果 30例服药后HBVDNA反跳病人中 ,基因芯片测得HBVYMDD变异 2 1例 ,其中YVDD变异11例 ,YIDD变异 10例。HBVDNAPCR直接序列测定结果为有核苷酸A741变为G ,使氨基酸由蛋氨酸 5 5 2变为缬氨酸 (氨基酸基序由YMDD变为YVDD) ,6例核苷酸A669变为C ,氨基酸由亮氨酸5 2 8变为蛋氨酸 ;核苷酸G743 变为T ,使氨基酸由蛋氨酸 5 5 2变为异亮氨酸。 (氨基酸基序由YMDD变为YIDD)。其中有 3例伴有核苷酸T781变为C ,使氨基酸由亮氨酸 5 6 5变为脯氨酸。标本阳性变异序号与基因芯片检测结果完全一致。结论 乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD、YIDD变异 ,与PCR直接测序法比较 ,准确率达 10 0 %。

YMDD自然变异毒株流行病学调查

目的了解YMDD自然变异的发生情况及影响YMDD自然变异的因素。方法依托国家食品药品监督管理局注册药物临床试验“阿德福韦酯片治疗成人慢性乙型肝炎的多中心、随机、双盲、对照临床研究(Ⅲ期)”开展。采用乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药荧光PCR检测试剂盒及实时荧光PCR基因型分型试剂盒,对该临床研究筛选期183例半年内未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者血清标本进行检测,并通过Logistic逐步回归对影响YMDD自然变异检出率的可能因素进行多因素分析。结果183例CHB患者中,检出YMDD自然变异毒株者40例(21.86%),其中YVDD阳性36例,YIDD阳性3例,YVDD和YIDD同时阳性者1例;变异毒株占总病毒量50%以上者6例,占25%～50%者9例,占9%～25%者25例。B基因型CHB患者中YMDD自然变异检测阳性的比例高于C基因型(31.67%对17.65%,P=0.0382),患者性别、年龄、HBeAg状态、血清HBVDNA载量及丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平对YMDD自然变异检出率无显著影响(P>0.05)。结论在CHB患者中存在YMDD自然变异毒株;YMDD自然变异的发生率与患者性别、年龄、HBeAg状态、HBVDNA水平、ALT水平无关。B基因型较C基因型更易出现YMDD自然变异。

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒YMDD野毒株和变异株的变化

目的 观察慢性乙型病毒性肝炎 (CHB)患者应用拉米夫定治疗前后 ,YMDD野毒株及变异株的动态变化 ,并分析其临床意义。方法 取 5例CHB患者治疗前与治疗 48周的 10份血清标本 ,先用PCR法扩增包括YMDD基序的乙型肝炎病毒 (HBV )部分核苷酸序列 ,然后进行DNA序列测定 ,同时分别进行克隆 ,每份标本随机挑选 2 0～ 2 4株单克隆 ,用实时荧光PCR法检测YMDD野毒株及其变异株。结果 5例CHB患者治疗前PCR产物直接测序结果未检出YMDD变异 ,治疗 48周时有 4例检出YMDD变异 ,但对每株克隆的分别检测显示 :治疗前YMDD变异株 (YIDD/YVDD)所占比率分别为 0 %、9.5 %、0 %、4.5 %、5 .6%;治疗 48周时所占比率分别为 10 0 %、10 0 %、65 %、10 0 %、0 %。其中 1例患者治疗前检出YIDD变异株 ,而治疗 48周时YVDD变异株则变成优势株。治疗 5 2周时 ,4例YMDD变异患者中 2例HBVDNA和血清丙氨酸转氨酶 (ALT)突破 ,1例患者ALT突破 ,但HBVDNA为阴性。结论 YMDD变异株在拉米夫定治疗前的血清中已存在 ,在服用拉米夫定后 ,由于选择性抑制了野毒株 ,使YMDD变异株由弱势株变成优势株 ,部分患者可导致拉米夫定临床耐药。

未经拉米夫定治疗HBVYMDD变异的临床分析

目的分析未经拉米夫定治疗的HBV病毒YMDD变异出现的情况,探讨HBV病毒YMDD变异出现可能的机理,了解以YMDD自然变异的慢性HBV感染患者的肝损害情况。方法对140例HBVDNA阳性,未经拉米夫定治疗的慢性HBV感染者进行YMDD检测,同时检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清总胆红素(TBIL)、白蛋白(ALB)、发病年龄、HBeAg与抗HBe等临床相关指标。结果140例未经拉米夫定治疗的慢性乙肝病毒感染者中20例自然发生YMDD变异,YMDD变异组与未变异组引起的肝损害无显著性差异(P>0.05)。YMDD变异与HBeAg与抗HBe的阳性表达无明显差异(P>0.05)。结论HBV病毒YMDD变异株作为一个准种与野毒株同时存在感染个体,YMDD变异对肝损害严重性无关,YMDD变异与HBeAg阳性率与抗HBe阳性率无明显差异。

基因芯片检测拉米夫定引起的乙型肝炎病毒基因YMDD变异的研究

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)变异基因诊断芯片,对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测诊断。方法:设计特异性寡核苷酸探针。用点样法制备HBV变异基因诊断芯片。选择住院患者30例服用拉米夫定后,HBVDNA转阴[<500拷贝(opies/ml)]68周后又反跳≥5000copies/ml的患者进行基因芯片杂交检测。同时用PCR直接测序法对30例患者血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。结果:30例服药后HBVDNA反跳患者中基因芯片测得HBVYMDD变异21例,其中YVDD变异11例,YIDD变异10例。直接序列测定发现有核苷酸A741变为G,使氨基酸由蛋氨酸552变为缬氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YVDD)11例,有6例核苷酸A669变为C,使氨基酸由亮氨酸528变为蛋氨酸;核苷酸G743变为T,使氨基酸由蛋氨酸552变为异亮氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YIDD)10例。其中有3例伴有核苷酸T781变为C,使氨基酸由亮氨酸565变为脯氨酸。其结果与基因芯片完全一致。结论:HBV变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD、YIDD变异,同PCR直接测序法比较,准确率达100%,无假阳性。

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV YMDD变异及基因芯片检测

建立乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测方法。设计特异性寡核苷酸探针数组 ,特殊处理芯片载体。用点样法制备乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片。在本院住院治疗病人中选择 3 0例服用拉米夫定后 ,可能出现YMDD变异的病人进行基因芯片杂交检测分析 ;同时用PCR直接测序法对上述 3 0例病人血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。 3 0例服药后HBVDNA反跳病人中 ,基因芯片测得HBVYMDD变异 2 1例 ,其中YVDD变异 11例。YIDD变异 10例。HBVDNAPCR直接序列测定结果与基因芯片检测结果完全一致。乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD、YIDD变异 ,同PCR直接测序法比较 ,准确率达 10 0 % 。

使用/未用拉米夫定HBV慢性感染者中YMDD基序变异的检测

目的 探讨接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎病毒 (HBV)感染者YMDD基序变异的分子生物学机理。方法 以RFLP法筛选HBVYMDD基序变异 ,阳性者作直接测序的方法 ,分别检测 1 9例正在应用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者以及 86例未用拉米夫定的HBV感染者的血清标本。结果 1 9例正在应用拉米夫定治疗的患者中检测出 2例YMDD基序变异 ,测序结果分别为YIDD和YVDD变异。在 86例未用拉米夫定或其他抗病毒药物治疗的HBV感染者中检测出 3例YMDD基序变异 ,测序结果分别为YIDD 1例和YVDD 2例。结论 在未用拉米夫定的HBV感染者中同样存在着YMDD基序变异 。

乙肝病毒YMDD区变异后不同抗病毒疗法效果的系统评价

目的 系统评价与拉米夫定相关的乙型肝炎病毒YMDD区变异后不同抗病毒治疗方法的疗效和安全性。方法 计算机检索MEDLINE ( 1989～ 2 0 0 4 4 )、EMBASE ( 1989～ 2 0 0 4 4 )和中国生物医学文献数据库 ( 1989～ 2 0 0 4 4 ) ;手工检索未发表的中文学术会议文献。收集与拉米夫定相关的乙型肝炎病毒YMDD区变异后不同抗病毒疗法的临床随机与半随机对照试验 ,由两名评价者独立评价和提取资料 ,并采用Cochrane协作网专用软件RevMan 4 2进行统计分析。结果 共纳入 5篇随机和半随机对照研究 ,包括 6个试验组 2 84例病人。Meta分析结果显示 ,拉米夫定 +阿德福韦治疗对HBVDNA、HBeAg转阴率及ALT复常率的效果明显优于单独应用拉米夫定 ,其RR和 95 %CI分别为 16 6 1( 2 2 9,12 0 71) ,6 6 6 ( 1 2 3,35 88)和6 2 6 ( 2 2 9,17 12 )。氧化苦参碱 +胸腺肽对HBVDNA、HBeAg转阴率明显优于单独应用拉米夫定 ,其RR和 95 %CI分别为 2 96 ( 1 2 6 ,6 93) ,2 5 1( 1 0 5 ,5 98)。试验组单独使用阿德福韦与拉米夫定比较 ,两者在HBVDNA及HBeAg转阴率方面差异无统计学意义 [RR 11 0 0 ,95 %CI( 0 6 5 ,186 0 2 ) ;RR 7 0 0 ,95 %CI( 0 39,12 6 92 ) ];干扰素 +拉米夫定对HBVDNA转阴率、HBeAg转阴率。

慢性HBV携带者YMDD自然变异的追踪研究

目的探讨慢性HBV携带者YMDD自然变异随时间的推移发生变化的情况。方法随机选择未经抗病毒治疗的慢性HBV携带者103例,分别在开始、1年、2年时观察血清HBV DNA、HBV血清学标志物、肝功能、YMDD变异的变化情况。结果在开始检测的103例慢性HBV携带者中,YMDD阳性27例,观察2年后4例转为非活动性HBsAg携带者且YMDD转为阴性;76例YVDD变异阴性的患者中,观察2年后1例病毒水平增高并出现YMDD变异。结论 YMDD自然变异株在慢性HBV携带者中相对较稳定,YMDD自然变异株可随野生株的消失而消失。

家庭聚集性慢性HBV感染者HBV YMDD自然变异的调查

目的:探讨家庭聚集性慢性HBV感染者HBVYMDD自然变异发生情况以及影响其变异的因素.方法:筛选34个共95例有乙型肝炎家庭聚集现象且未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者作为家庭组,进行YMDD检测;随机选择82例无乙型肝炎家庭聚集现象且未接受过抗病毒治疗的CHB患者作为对照组,进行YMDD检测.结果:家庭组95例中有51例(53.68%)检测到YMDD自然变异,对照组82例中有21例(25.61%)检测到YMDD自然变异;YMDD自然变异检出率有显著性差异(P<0.05).结论:有乙型肝炎家族聚集史慢性HBV感染者的YMDD自然变异率较没有乙型肝炎家族聚集史慢性HBV感染者的YMDD自然变异率高.

20岁以下免疫耐受期慢性乙肝YMDD自然变异的流行病学调查

目的探讨20岁（含20岁,下同）以下免疫耐受期慢性乙肝患者YMDD自然变异的发生情况及影响其变异的因素。方法筛选110例20岁以下处于免疫耐受期且从未接受过抗病毒治疗的慢性乙肝（chronic hepatitis B,CHB）患者,检测其YMDD变异情况。结果 110例患者检测出YMDD变异31例（28.18%）,其中YIDD阳性9例、YVDD阳性6例,YIDD和YVDD同时阳性16例。患者性别、年龄、HBeAg状态、血清HBV DNA水平及丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平对YMDD自然变异检出率无显著影响（P〉0.05）。结论 20岁以下处于免疫耐受期的CHB患者存在YMDD自然变异,其自然变异的发生率与患者性别、HBeAg水平、血清HBVDNA水平及丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平无明显相关。

荧光PCR法检测乙型肝炎病毒YMDD基因变异的研究

目的探讨荧光PCR法在检测酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)基因变异上的临床应用价值及其拉米夫定治疗一年慢性乙型肝炎(CHB)患者发生YMDD基因变异的情况。方法61例HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)HBVDNA(+)CHB患者接受拉米夫定治疗一年,采用荧光定量PCR法检测其血清HBVDNA含量,ELISA法检测血清乙肝五项标志物,动力学法检测血清谷丙转氨酶(ALT)含量。HBVYMDD基因变异采用荧光PCR法进行检测。结果61例CHB患者经拉米夫定治疗一年后HBV-DNA阳性率降至34.4%(21/61),YMDD基因变异发生率18.0%(11/61),分析YMDD基因变异类型:4例为混合变异,其中3例为YMDD+YIDD,1例为YMDD+YVDD;7例为完全变异,其中5例为YIDD,2例为YVDD。变异患者组无1例出现HBeAb血清学转换,血清HBVDNA含量106.6±0.8(copies/ml),明显高于HBVDNA(+)无变异组(P<0.05),ALT含量123.8±53.8(U/L),明显高于HBVDNA(-)无变异组(P<0.01)。结论YMDD基因变异CHB患者HBVDNA均反跳,伴有ALT升高,及时了解CHB患者有无YMDD基因变异对避免造成患者不必要的经济负担、指导临床合理用药具有重要意义。荧光PCR法用于检测YMDD基因变异,具有经济实用、自动化程度高、简便快捷的优点。

PCR熔解曲线法检测HBV YMDD自然变异

目的了解未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者乙肝病毒YMDD自然变异流行状况及特点。方法选择未接受过抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者119例,采用荧光标记杂交双探针PCR熔解曲线法(FH-PCR-MC)对其血浆标本进行YMDD基因序列突变检测。结果119例患者中,有23例存在YMDD自然变异毒株,变异检出率为19.3%,其中YVDD阳性者20例(87.0%),YIDD阳性者2例(8.7%),YVDD和YIDD同时阳性者1例(4.3%)。23例出现自然变异毒株的患者,其体内病毒均为变异株与野生株共生,且变异株为非优势株,变异株在总病毒量中所占的比例均在50%以下。变异毒株占总病毒量的40%～50%者4例,30%～40%者6例,20%～30%者6例,20%以下者7例。结论未经抗病毒治疗的CHB患者存在YMDD自然变异毒株,且变异株与野生株共生,为非优势株。

血清HBV-DNA定量水平与拉米夫定抗HBV感染中YMDD变异的相关性研究

观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎 (CHB)YMDD变异的产生与血清HBV DNA水平的关系。方法 选择应用拉米夫定治疗并产生YMDD变异的CHB患者 5 3例 ,分析血清HBV DNA水平与YMDD变异类型、产生时间的关系。另选择具有可比性的应用拉米夫定治疗但并未产生YMDD变异的CHB患者 5 3例 (1:1配对 )对比分析治疗前血清HBV DNA定量水平。结果 YMDD变异组治疗前血清HBV DNA定量水平显著高于未产生YMDD变异组 (P <0 .0 1)。YMDD变异类型与血清HBV DNA定量水平不相关 (P >0 .0 5 ) ,但YMDD变异产生时间与血清HBV DNA定量水平相关 (P <0 .0 5 )。结论 CHB患者血清HBV DNA水平越高 ,应用拉米夫定治疗越容易产生YMDD变异 ,且产生时间越早。血清HBV DNA水平可作为应用拉米夫定治疗YMDD变异产生的早期预测指标。YMDD变异类型与血清HBV DNA水平不相关。

拉米夫定联合苦参素治疗慢性乙型肝炎疗效及对YMDD变异的影响

目的:观察拉米夫定和苦参素联合治疗慢性乙型肝炎的疗效及对慢性乙型肝炎病毒P基因(YMDD)变异的影响。方法:将60例慢性乙型肝炎病例分为苦参素组、拉米夫定组和联合治疗组3组,每组20例。苦参素组口服苦参素胶囊,拉米夫定组口服拉米夫定,联合治疗组口服苦参素胶囊和拉米夫定,疗程为12个月。治疗结束后,分别检测血清HBeAg、抗-HBe、HBV DNA和基因YMDD变异。结果:在治疗12个月时,联合治疗组HBeAg、抗-HBe转换率及HBV DNA转阴率优于苦参素组和拉米夫定组,YMDD变异率较苦参组和拉米夫定组低,但差异比较无统计学意义(P>0.05)。上述各指标苦参组和拉米夫定组组间比较均无统计学意义(P>0.05)。结论:拉米夫定联合苦参素能在一定程度上提高治疗慢性乙型肝炎的疗效并可减少YMDD变异。

乙型肝炎病毒检测YMDD基序变异情况分析

目的调查乙肝患者HBVDNAYMDD基序突变情况，为医院肝病临床治疗前评估、优化治疗方案提供依据。方法收集2012年1月～7月间乙肝患者580份血清标本，进行HBVDNA检测和YMDD基序变异检测，并进行统计学分析。结果580份标本有351份血清中HBVDNA〉1×103 copies／ml，发生YMDD基序突变的血清为43份；不同病毒载量区间YMDD基序变异患者比例之间差异有统计学意义，YMDD基序变异患者分布与病毒载量高低存在负相关关系（卡方检验和Pearson相关性检验P均〈0．05）；高变异病毒载量的患者之一在接受ETV和ADV优化治疗3个月后，病毒栽量降至105copies／ml。结论YMDD基序变异会导致患者对NA类药物的敏感性降低，及时的基因突变检测能够对耐药进行预测，预防耐药发生，为肝病治疗方案的优化提供依据。

实时定量PCR检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变及其与临床指标的相关性

目的采用实时定量PCR检测接受与未接受拉米夫定治疗的乙肝患者血清中乙肝病毒(HBV)突变情况,并将检测结果与临床指标进行相关性分析。方法采用touch-down PCR反应程序,并结合SYBR Green Ⅰ染料进行实时定量PCR,检测115份乙肝患者血清标本(其中50名患者未服用过拉米夫定,65名患者服用过拉米夫定)。随机选择115份标本中的30份用同样的方法提取血清DNA,进行PCR扩增及测序,并与实时定量PCR检测结果进行比较。将乙肝病毒YMDD突变实时定量PCR检测结果与临床各指标之间进行相关性分析。结果115份血清标本中,75份含有野生型HBV(其中49份来自未接受过拉米夫定治疗的患者),40份含有YMDD突变的HBV(其中1份来自未接受过拉米夫定治疗的患者);180位点的突变检测中,98份标本含有野生型HBV,17份标本含有突变型HBV。随机选取的30份标本测序结果与实时定量PCR检测结果完全一致。乙肝病毒拉米夫定耐药突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间无相关性,而乙肝病毒YMDD变异与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性,用药时间越长,发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后,180和204位点突变具有相关性。结论实时定量PCR可以高效、准确地检测拉米夫定治疗后乙肝病毒的耐药突变。

拉米夫定耐药HBV毒株的RT区序列分析

目的 分析拉米夫定耐药HBV毒株部分RT区序列 ,以了解RT区YMDD基序之外HBV的变异情况。方法 采用PCR方法对拉米夫定临床耐药患者治疗前及耐药后血清HBV部分RT区序列进行扩增 ,扩增的核苷酸片段覆盖HBVRT的B区～E区及S基因“a”决定簇 ,对PCR产物进行直接测序 ,将HBVRT区核苷酸和推导的氨基酸序列与治疗前 5 0株HBV野毒株序列和Genebank中 77株不同基因型野毒株序列进行比较 ,同时对HBV进行血清分型。结果 60例患者有YMDD变异 ,其中 2 6例为adw亚型 ,占 43 .3 3 % ;3 4例为adr亚型 ,占 5 6.67%。另外 12例患者( 16.67% )未发现YMDD变异。 16例患者出现 11个RT保守区氨基酸变异 (不包括 5 5 0和 5 2 6位氨基酸变异 ) ;2 5例患者出现 19个HBVRT非保守区氨基酸变异。结论 拉米夫定耐药株的氨基酸变异不仅见于RTB区的 5 2 6和C区 5 5 0两个位点 ,B、C区的其他位点、保守区以及RT非保守区也可发生多个变异。