高效毕赤酵母表达载体的改造与应用

构建一种可促进外源蛋白在毕赤酵母中高表达的载体,实现在同一载体中外源基因与二硫键异构酶共表达,同时失活YPS1基因。以p PICZαA载体为骨架载体,将酵母YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至p PICZαA载体,获得重组载体p PICZαA-YPSΔ;将酵母PDI基因序列连接至p PICZαA载体,获得重组载体p PICZαAPDI,再以重组载体p PICZαA-PDI为模板通过PCR获得PDI表达盒,然后将PDI表达盒连接至重组载体p PICZαAYPSΔ,筛选获得高效表达载体p PICZαA-PDI-YPSΔ。最后,将外源基因HSA、h GH导入此载体,转化毕赤酵母GS115,检测HSA和h GH蛋白的表达。结果显示,高效表达载体p PICZαA-PDI-YPSΔ构建成功,外源蛋白HSA、h GH利用此载体,可获得高表达,具有很好的工业前景。

毕赤酵母YPS1基因的失活对减少重组人血清白蛋白降解的作用

重组人血清白蛋白在毕赤酵母系统的分泌表达产物除了完整的重组人血清白蛋白外,还存在一约45ku大小的主要降解片段,直接影响了重组人血清白蛋白的产量和后续的纯化研究.为了减少重组人血清白蛋白的降解,采用同源重组的方法,使毕赤酵母中蛋白酶基因YPS1失活,构建获得蛋白酶缺陷型菌株,研究YPS1基因失活后对重组人血清白蛋白降解的影响.结果表明,毕赤酵母YPS1基因的失活有效地减少了重组人血清白蛋白的降解,完整的重组人血清白蛋白在总蛋白中的比例由原来的60%提高到88%,降解片段由原先的40%降低到10%左右.

YPS1/YPS2失活改进酿酒酵母An-α菌株β-葡萄糖苷酶分泌表达

【背景】工业酵母菌株的蛋白质表达通常存在表达量低、分泌效率低的问题。【目的】考察失活Yapsin蛋白酶Yps1p和Yps2p对β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母An-α菌株中表达的影响。【方法】利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,首先构建得到未折叠蛋白响应(Unfolded Protein Response,UPR)指示菌株An-α(leu2::UPRE-lac Z)即An-αL,然后分别失活其YPS1和YPS2基因,导入以YEplac195为载体的β-葡萄糖苷酶表达质粒(简称BG),进行生长和酶活分析评价。【结果】菌株An-αL的YPS1和YPS2基因失活对其在酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Extract Peptone Dextrose,YPD)培养基中的生长未造成明显的不利影响;导入质粒BG后将在酵母浸出粉胨纤维二糖(Yeast Extract Peptone Cellobiose,YPC)培养基中生长的最大OD_(600)分别提高了21.9%和7.4%;最大总酶活值为0.087 5和0.068 6 U/(m L·OD_(600)),是对照菌株相应值的2.268倍和1.778倍;分泌比例提高了19.4%和22.2%;β-葡萄糖苷酶表达水平与β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR信号响应值之间呈现良好的相关性。【结论】YPS1和YPS2基因失活有助于改进酿酒酵母An-α菌株中β-葡萄糖苷酶的分泌表达。