化风丹药母中3种优势微生物的实时荧光定量PCR方法的建立

目的:建立化风丹药母中3种优势微生物米曲霉(Aspergillus oryzae)、汉逊德巴利酵母菌(Debaryomyces hansenii)、阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)快速、有效的实时荧光定量PCR检测方法。方法:以米曲霉、汉逊德巴利酵母菌、阿氏芽孢杆菌的重组质粒为标准质粒,设计特异性引物并进行特异性、灵敏性及重复性实验。结果:3种优势微生物的熔解曲线不在同一峰值。米曲霉、汉逊德巴利酵母菌、阿氏芽孢杆菌的荧光定量PCR最低检测限度分别为0.256、514、5.08 copies/μL。不同质量浓度的标准质粒变异系数(CV)均小于5%。结论:研究表明以荧光定量PCR技术建立的米曲霉、汉逊德巴利酵母菌、阿氏芽孢杆菌的检测方法具有重复性好、特异性强、灵敏度高等优点,可用于化风丹药母发酵过程中微生物的检测及定量。

化风丹血清药物化学的初步研究

目的:对化风丹血清药物化学进行研究,初步探讨其药效物质基础。方法:采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法,同时建立化风丹提取物以及大鼠ig化风丹(6 g/kg)、药母(1.37 g/kg)、药母阴性样品(5.73 g/kg)提取物后含药血清的指纹图谱,分别在正、负离子检测模式下通过比较化风丹和含药血清的指纹图谱,初步鉴定化风丹在大鼠血中移行成分及其代谢产物。结果:在负离子模式下含药血清中共发现8个药源性成分(其中3个为原型成分,5个可能为代谢产物),有6个来自药母;在正离子模式下含药血清中共发现9个药源性成分(其中2个为原型成分,7个可能为代谢产物),有6个来自药母。结论:初步确定了化风丹的入血成分,其入血成分主要来自药母。

药母灌胃大鼠血清中药物化学成分初步研究

目的:研究药母灌胃大鼠血清中药物化学成分。方法:20只SD大鼠均分为空白组和药母组,药母组SD大鼠使用400 g/L的药母提取液按1.37 g/kg进行灌胃,空白组灌胃同等体积的蒸馏水,连续给药3 d,收集两组大鼠血清;利用超高压液相色谱-飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF)技术检测药母提取物、药母组及空白组大鼠血清的指纹图谱,比较3种指纹图谱异同,分析药母灌胃大鼠血清中的移行成分。结果:药母灌胃后大鼠血清中在正负模式下共发现30个药源性成分,其中15个原型成分,15个代谢产物。结论:灌胃后大鼠血中移行成分及代谢产物可能为药母在体内直接的作用物质。

化风丹药母指纹图谱的建立及不同发酵时间样品中7种核苷类成分的含量测定

目的:建立化风丹药母的指纹图谱,并测定不同发酵时间样品中7种核苷类成分的含量。方法:采用高效液相色谱法(HPLC),色谱柱为Pntulips BP-C18,流动相为甲醇-水(梯度洗脱),流速为0.8 mL/min,检测波长为260 nm,柱温为35℃,进样量为10μL。以黄嘌呤为参照,绘制12批化风丹药母的HPLC指纹图谱;采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行相似度评价,确定共有峰;同法测定不同发酵时间(0、1、2、3、4周)样品中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷的含量。结果:12批化风丹药母共有8个共有峰,相似度为0.712~0.954;指认了7种成分,分别为尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷。不同发酵时间样品中上述7种成分检测质量浓度的线性范围分别为0.87~8.7μg/mL(r=0.9996)、1.51~15.1μg/m L(r=0.9997)、6.08~60.8μg/m L(r=0.9995)、1.52~15.2μg/m L(r=0.9996)、1.82~18.2μg/mL(r=0.9996)、1.48~14.8μg/m L(r=0.9996)、1.63~16.3μg/mL(r=0.9993);定量限分别为0.0274、0.0763、0.2504、0.1723、0.1011、0.0783、0.0842μg/mL,检测限分别为0.0087、0.0255、0.0079、0.0841、0.0357、0.0269、0.0275μg/m L;精密度、重复性、稳定性(12 h)试验的RSD均小于3%;加样回收率分别为94.16%~100.16%(RSD=2.24%,n=6),93.87%~100.65%(RSD=2.67%,n=6),93.52%~99.66%(RSD=2.30%,n=6),93.67%~98.24%(RSD=1.89%,n=6),96.00%~102.18%(RSD=1.96%,n=6),94.62%~101.54%(RSD=2.82%,n=6),97.72%~104.56%(RSD=2.97%,n=6)。发酵0~4周时,上述7种成分及总核苷的含量分别为0.042~0.232、0.027~0.181、0.039~0.651、0.026~0.225、0.034~0.111、0.009~0.124、0.079~0.099、0.647~1.292 mg/g;发酵1~4周时的尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤及总核苷的含量均较发酵0周时显著升高,而尿苷、肌苷、鸟苷的含量较发酵0周时显著降低。结论:所建指纹图谱特征性强且操作简便,可用于化风丹药母的质量控制;含量测定方法准确、可靠,可用于同时测定其中7种核苷类有效成分的含量;化风丹药母中的核苷类成分含量受发酵时间的影响。

化风丹药母发酵过程中优势菌种分离鉴定及不同温度和pH值下菌株生长情况

目的对化风丹药母发酵过程中优势菌种进行分离鉴定,考察不同温度和pH值对优势菌株生长的影响。方法用选择性培养基对化风丹药母发酵过程中0周至6周样品中的细菌、霉菌、酵母菌分别进行培养、菌落计数、分离纯化优势菌种;采用16S rDNA,26S rDNA序列对优势细菌和真菌进行鉴定;分别考察阿氏芽孢杆菌、汉逊德巴利酵母菌、米曲霉的最适宜生长温度、pH值。结果化风丹药母发酵过程中细菌0周至4周数量增加,4周至6周数量趋于稳定;酵母菌在发酵0周至3周时数量增加,4周至6周数量不断减少;霉菌在0周时没有生长,1周至4周数量平稳增加,5周至6周霉菌数量呈现下降趋势。通过构建系统发育树,鉴定筛选出化风丹药母发酵过程中的优势菌种,以阿氏芽孢杆菌、汉逊德巴利酵母菌、米曲霉为研究对象,其生长的最适温度分别为35、25~30、35℃;最适pH值分别为8、6、7。结论化风丹药母发酵过程中优势微生物分别为阿氏芽孢杆菌、汉逊德巴利酵母菌、米曲霉。

HPLC法测定化风丹药母在发酵过程中6个酯型生物碱的含量

目的:为控制化风丹药母的稳定性,探究化风丹药母在发酵过程中6个酯型生物碱的含量变化。方法:采用高效液相色谱法,选用色谱柱:Wondasil?C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相:以0.1 mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈-四氢呋喃,梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长235 nm,柱温30℃。结果:在此色谱条件下,6个酯型生物碱成分可达到较好分离,苯甲酰新乌头碱,苯甲酰乌头碱,苯甲酰次乌头碱,次乌头碱,新乌头碱,乌头碱进样量分别在0.086 48~1.383 68μg、0.032 4~0.518 4μg、0.027 44~0.439 04μg、0.094 24~1.507 84μg、0.084 48~1.351 68μg、0.022 8~0.364 8μg范围内呈现较好的线性关系,精密度、稳定性、重复性均较稳定,平均加样回收率分别为97.1%、96.3%、95.2%、94.4%、93.4%、94.4%。发酵6周后,单酯型总生物碱含量变化为4.52%~7.36%,双酯型总生物碱含量变化为12.40%~6.35%。结论:通过发酵后,单酯型生物碱含量有所增加,双酯型生物碱含量有所降低,化风丹药母毒性降低。