朊蛋白(prp23-231)酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

PCR扩增小鼠朊蛋白(prp23-231)基因,克隆入诱饵载体pSos,将重组质粒与对照质粒共转化酵母菌cdc25H,成功地构建了小鼠朊蛋白(prp23-231)酵母双杂交诱饵载体pSos-prp23-231,并证实该段基因表达的蛋白对酵母菌cdc25H既无毒性,也没有自激活作用。

蓖麻毒素B链(RTB)酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

采用PCR技术扩增蓖麻毒素B链基因,并克隆入诱饵载体pSos中,成功地构建了酵母双杂交诱饵载体pSos-RTB。将重组质粒与对照质粒共转化入酵母菌cdc25H。结果表明:该段基因表达的蛋白对酵母菌cdc25H无毒性和无自激活作用,且在酵母细胞中定位正确。

FasL蛋白及其相互作用蛋白对直肠癌细胞耐药性影响的研究

目的:探讨FasL蛋白及其相互作用蛋白在直肠癌细胞耐药中的作用机制。方法:利用酵母双杂交系统在相互作用蛋白研究中的特性,筛选与FasL蛋白相互作用较强的蛋白质,通过细胞学实验(MTT法)研究FasL蛋白及其相互作用蛋白对直肠癌细胞耐药性的影响。结果:经过筛选发现,FasL蛋白与anchor attachment蛋白、金属硫蛋白1K具有较强的相互作用。经细胞耐药学实验证实,FasL蛋白、anchor attachment蛋白与金属硫蛋白1K组直肠癌HR-8348细胞的耐药性明显高于其他组细胞,差异具有非常显著性统计学意义(P<0.01),FasL蛋白组以及FasL蛋白和金属硫蛋白1K组直肠癌HP-8348细胞的耐药性均高于空白对照组,差异具有显著性统计学意义(P<0.05)。结论:FasL蛋白与anchor attachment蛋白1K结合后,增强了金属硫蛋白1K在结直肠癌细胞中的耐药能力,可能促进了结直肠癌的复发与转移。

酵母双杂交系统研究及其应用进展

综述了自酵母双杂交系统建立以来主要的研究及其应用进展状况,包括:基本原理、一般操作程序、杂交系统研究发展历程、主要应用研究进展、存在问题及其前景等。

酵母双杂交筛选人肝细胞文库戊肝病毒pORF3结合蛋白

目的筛选人肝细胞文库戊肝病毒pORF3结合蛋白,为HEVORF3蛋白的功能研究提供依据。方法构建pSOS-baitORF3诱饵重组载体,诱饵蛋白的自激活检测以及表达验证后,筛选cDNA文库中HEVORF3相互作用蛋白。结果经验证pSOS-baitORF3诱饵重组载体构建成功,诱饵蛋白的自激活检测以及表达验证均符合预期结果,共筛选出八种相互作用蛋白。结论筛选出的蛋白基本上为功能性蛋白,其中包括免疫信号通路激酶p110δ以及线粒体膜蛋白,和补体系统C3等,有进一步研究的价值。

水稻愈伤诱导过程中生长素通路的初步研究

构建水稻LBD基因家族中CRL1基因的CRISPR/CAS9基因敲除载体,并转化中花11水稻愈伤,获得了8个转基因片段缺失家系;对CRL1基因敲除材料种子进行愈伤诱导实验;结果显示,它们的愈伤组织诱导受到了强烈抑制,与已知的水稻OsIAA10基因的RNA干扰材料表型相似。进行OsIAA10的亚细胞定位实验,结果显示,OsIAA10同时定位在细胞核与细胞膜上。通过酵母双杂交筛库实验,发现OsIAA10能与OsARF家族成员中的OsARF5、OsARF1、OsARF721、OsARF23四个转录因子发生互作。以CRL1基因启动子为诱饵构建载体,进行酵母单杂交点对点实验,结果显示,这4个转录因子中只有OsARF5与OsARF21能特异性结合CRL1基因启动子区的AuxRE基序,激活CRL1基因转录。本研究结果初步证明水稻侧根发育通路与愈伤组织诱导过程存在直接相关,水稻与双子叶植物之间存在保守的生长素调控机制,在水稻种子的愈伤组织诱导过程中发挥着重要的作用。

基于RNA聚合酶靶点的抗流感病毒药物筛选系统的鉴定

目的鉴定基于聚合酶亚基间相互作用的靶点特异性抗流感病毒药物筛选酵母双杂交体系。方法挑取筛选平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal阳性单菌落(共转化质粒PB1-pGBKT7与PA-pGADT7的AH109酵母细胞)接种培养,PCR验证重组质粒共转是否成功;glass-beads法提取酵母总蛋白,Western-blot验证融合蛋白在酵母细胞中是否表达;将PB1-pGBKT7质粒PB1基因克隆至载体pAcGFP1-C,PA-pGADT7质粒PA基因克隆至载体pProLabel-C,将构建的重组质粒PB1-pAcGFP1、PA-pProLabel共转染人胚肾GP2-293细胞,Co-IP验证在哺乳动物细胞中流感病毒聚合酶亚基PB1、PA具有相互作用。结果 PB1、PA基因PCR结果均为阳性;PB1-Myc融合蛋白Western-blot结果为阴性,PA-HA融合蛋白Western-blot结果为阳性;PB1-pAcGFP1、PA-pProLabel重组质粒PCR验证结果 PB1、PA基因阳性;Western-blot检测PB1-GFP融合蛋白阳性;Co-IP结果表明流感病毒RNA聚合酶亚基PB1与PA在哺乳动物细胞内具有相互作用。结论基于RNA聚合酶亚基间相互作用的抗流感病毒药物筛选系统构建成功,可以用于抗流感病毒靶点特异性的高通量药物的筛选。

细胞周期末期促进复合物亚基CDC16Hs与DNA双链断端修复蛋白Ku80相互作用

CDC16Hs是细胞周期末期促进复合物 (APC)的亚基 .利用基于LexA的酵母双杂交系统 ,把它作为诱饵蛋白筛选人胎脑文库 ,发现它与DNA双链断端修复蛋白Ku80的羧基端相互作用 .CDC16Hs和全长Ku80的结合通过 pulldown实验在体外得到验证 .

应用酵母双杂交技术筛选与癌性锚蛋白重复序列相互作用的蛋白

目的:筛选与癌性锚蛋白重复序列(Gankyrin)相互作用的蛋白。方法:构建诱饵(Bait)质粒pGB-Psmd10-1,采用β-半乳糖苷酶滤膜分析检测其自身转录活性,以Bait质粒筛选人Hela细胞MATCHMAKER cDNA文库,共转染重复验证阳性克隆,并测序鉴定。结果:成功构建Bait质粒,经验证对报告基因LacZ无自激活作用。以Bait质粒筛选人Hela细胞cDNA文库,获得83个克隆,其中5个克隆经重复验证确定为阳性克隆,测序结果显示其cDNA为Psmc4的3段不同剪接体(NM_006503.2,NM_153001.1)。结论:在人Hela细胞中,Psmc4为与Gankyrin相互作用的蛋白。