Carfilzomib联合Z-VAD-FMK对肿瘤恶病质的防治作用

目的评价联合运用蛋白酶体抑制剂Carfilzomib与Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对肿瘤恶病质的防治作用及其机制。方法 BALB/c小鼠前腋皮下接种结肠腺癌C26细胞,建立肿瘤恶病质动物模型。随后在不同时间点给予Carfilzomib和Z-VAD-FMK单独与联合用药,检测荷瘤小鼠体质量、腓肠肌质量、肿瘤质量和体积、自发性生理活动和生存时间;qRT-PCR和Western blot检测腓肠肌Caspase3、MuRF1和MAFbx的mRNA表达水平和蛋白水平。结果 Carfilzomib与Z-VAD-FMK联合作用缓解荷瘤小鼠体质量下降,抑制骨骼肌萎缩和肿瘤生长,提高自发性生理活动和延长生存时间;减少腓肠肌MuRF1、MAFbx和Caspase3表达;联合作用大于单独用药(P<0.05),预防作用明显大于治疗作用(P<0.05)。结论 Carfilzomib与Z-VAD-FMK联合作用抑制了恶病质荷瘤小鼠腓肠肌泛素蛋白酶体通路和凋亡通路,可以预防和治疗肿瘤恶病质的发生、发展。

LPS联合z-VAD-FMK介导IFN-γ预处理巨噬细胞发生程序性坏死

目的:探讨脂多糖(LPS)联合z-VAD-FMK介导M1亚型巨噬细胞程序性坏死的机制。方法:使用佛波酯(PMA)和干扰素γ(IFN-γ)诱导THP-1细胞系分化得到M0和M1亚型巨噬细胞。以LPS(100μg/L)分别处理M0和M1巨噬细胞,检测不同时点的乳酸脱氢酶释放和DNA断裂情况,并观察不同抑制剂的影响。采用Western blot法检测受体相互作用蛋白(RIP)1、RIP3、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38和NOD样受体蛋白3(NLRP3)的蛋白水平。结果:LPS能够诱导M1亚型巨噬细胞发生死亡,联合z-VAD-FMK可特异性介导M1亚型巨噬细胞发生程序性坏死,而对M0亚型巨噬细胞无此作用。IFN-γ能够上调RIP3表达,并增强LPS介导的JNK磷酸化,RIP3和JNK抑制剂可部分阻断LPS联合z-VAD-FMK介导的M1亚型巨噬细胞程序性坏死。结论:IFN-γ上调RIP3和增强LPS介导的JNK磷酸化,使得LPS联合z-VAD-FMK能特异性诱导经过IFN-γ预处理的巨噬细胞发生程序性坏死。

z-VAD-FMK对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨z-VAD-FMK对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响及其机制。方法:30只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组、对照组(DMSO组)、给药组(z-VAD-FMK组),每组10只。对照组和给药组大鼠采用切除右肾,夹闭左侧肾动脉45 min后再恢复血流的方法制成肾缺血再灌注模型,于模型完成前15 min尾静脉给药;假手术组只切除右肾。模型成功后24 h收集大鼠血清和肾脏组织;测定血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN);HE染色观察肾组织病理改变;TUNEL检测肾细胞凋亡;ELISA检测TNF-α、IL-10浓度;Western blot检测caspase-3和caspase-8表达。结果:与对照组相比,给药组Scr与BUN水平明显降低(P<0.01);HE染色可见肾小管上皮细胞脱落、间质水肿、炎细胞浸润明显减少;肾小球和肾小管上皮细胞凋亡指数明显降低(P<0.01);TNF-α、IL-10表达水平明显降低(P<0.01);caspase-3和caspase-8表达明显降低(P<0.01)。结论:z-VAD-FMK对大鼠肾缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能与抑制细胞凋亡,减轻炎症损伤有关。

z-VAD-FMK与Necrostatin-1联合对MODS大鼠器官的保护作用研究

目的:探讨z-VAD-FMK与Necrostatin-1联合对MODS大鼠器官的保护作用。方法:采用失血性休克-内毒素"二次打击"建立大鼠MODS动物模型。将80只雄性SD大鼠随机分为4组:z-VAD-FMK组、Nec-1组、z-VAD-FMK+Nec-1组、模型组,每组20只,观察72 h死亡率。另取40只雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组、z-VAD-FMK组、Nec-1组、z-VAD-FMK+Nec-1组、模型组,每组8只,分别于注射内毒素和生理盐水后24 h收集血清和肝、肺、肠组织。全自动生化仪检测血清ALT、AST的变化,血气分析仪检测PaO2的变化,ELISA检测血清TNF-α、IL-1β的变化,HE染色观察肝、肺、肠组织的病理学改变。结果:大鼠遭受失血性休克-内毒素"二次打击"后,血清ALT、AST明显升高(P<0.01),PaO2显著下降(P<0.01),血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平明显升高(P<0.01)。光镜下见肝窦明显扩张、淤血,肝小叶结构紊乱,肝细胞部分变性、坏死;肺泡壁结构被破坏,肺间质充血,大量炎性细胞浸润;肠绒毛结构被破坏,部分绒毛顶部细胞、隐窝细胞变性、坏死,大量炎性细胞浸润。而z-VADFMK组、Nec-1组及z-VAD-FMK+Nec-1组ALT、AST升高程度、PaO2下降程度、TNF-α、IL-1β升高程度均显著低于模型组(P<0.01),以z-VAD-FMK+Nec-1组变化最明显。72 h死亡率均较模型组显著降低(P<0.05)。结论:z-VAD-FMK、Nec-1、z-VADFMK+Nec-1联合治疗均可显著减轻MODS大鼠的器官损伤,联合治疗效果更佳。

延迟注射Z-VAD-fmk对局灶性脑缺血神经功能及梗死面积的影响

目的研究延迟注射Z-VAD-fmk对局灶性脑缺血神经功能及梗死面积的影响。方法将60只大鼠,随机分为生理盐水对照组、Z-VAD-fmk治疗组,制成大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑梗死动物模型(MCAO),每天进行神经功能评分,并分别在MCAO术后第1天、第4天、第7天处死,利用图像分析仪测定梗死面积。结果在术后4h、第1天、第2天各组之间NSS评分统计学计算,无明显差异。从第4天开始,对照组和用药组之间差异非常显著。在第1天对照组和用药组间梗死面积差异不显著;而第4天和第7天在对照组和用药组间的损伤面积差异显著。结论延迟注射Z-VAD-fmk可以促进神经功能缺损的恢复速度和预后,并可在病理学水平减少梗死面积。

Caspase抑制剂z-VAD-fmk对大鼠烧伤后小肠组织损伤、细胞凋亡的影响及机制

目的观察广谱Caspase抑制剂z-VAD-fmk对大鼠烧伤后小肠组织损伤和细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法96只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、致伤组、治疗组,每组各32只。致伤组和治疗组制作严重烧伤大鼠模型;治疗组造模后即刻经尾静脉注射3 mg/kg的z-VAD-fmk,12 h后再次注射1.5 mg/kg;致伤组用等量生理盐水干预。分别于造模后2、8、24、48 h处死大鼠并留取小肠组织,采用HE染色观察小肠组织病理改变并评分,采用TUNEL法测算小肠黏膜细胞凋亡指数(AI),荧光比色法检测小肠黏膜细胞Caspase-3活性,免疫组化法检测小肠组织中的热休克蛋白70(HSP70)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2基因相关X基因(Bax)蛋白。结果致伤组、治疗组造模后2、8、24、48 h小肠组织病理评分高于对照组,治疗组各时点评分均低于致伤组(P均<0.05)。致伤组、治疗组造模后2、8、24、48 h小肠黏膜细胞AI及Caspase-3活性高于对照组,治疗组各时点均低于致伤组(P均<0.05)。致伤组、治疗组造模后2、8、24、48 h小肠组织中HSP70、Bcl-2、Bax表达均高于对照组,治疗组各时点HSP70、Bcl-2表达高于对照组,Bax表达低于致伤组(P均<0.05)。结论早期应用z-VAD-fmk可以有效减轻大鼠烧伤后小肠组织损伤、减少细胞凋亡,其机制可能与HSP70、Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达调节作用有关。

全反式维甲酸和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对胰腺癌细胞凋亡的作用

目的 观察全反式维甲酸 (ATRA)对体外胰腺癌细胞生长的影响以及 caspase抑制剂 Z-VAD- FMK对细胞凋亡的作用。方法 胰腺癌细胞 Pa Tu8988与 ATRA或与 ATRA+ caspase抑制剂Z- VAD- FMK共同孵育后 ,用 MTT方法观察细胞活性 ,观察细胞超微结构改变 ,DNA断裂分析 ,流式细胞仪检测凋亡细胞比例和测定 caspase- 3活性。结果 ATRA对细胞的生长有明显的抑制作用。 A-TRA诱导后电镜和 DNA断裂分析发现典型凋亡特征。与 ATRA处理组相比 ,ATRA和 Z- VAD- FMK联合作用对细胞凋亡比例无影响。ATRA组 caspase- 3蛋白的活性随孵育时间延长而升高 ,且与凋亡比例相关 ,Z- VAD- FMK处理组 caspase- 3活性明显下降。结论 ATRA能够抑制胰腺癌细胞生长并诱导细胞凋亡。同时 ,与 Z- VAD- FMK联合作用能抑制 caspase蛋白活性 ,但未使细胞凋亡比例相应降低 ,提示在胰腺癌凋亡过程中可能有其他蛋白酶的作用。

Z-VAD-FMK对外周刺激诱发的海马长时程增强的调制

目的探讨Z-VAD-FMK对外周刺激诱发的海马CA1区LTP的调制作用。方法20只雄性SD大鼠180-250 g,随机分为4组,单刺激坐骨神经诱发海马CA1区场电位。对照组强直刺激坐骨神经,诱发海马CA1区LTP。药物组在强直刺激前,于侧脑室微量注入大、中、小不同剂量的Z-VAD-FMK,10 min后强直刺激坐骨神经,诱导海马CA1区LTP,比较海马CA1区诱发场电位幅度在强直刺激前后的变化。结果①电刺激坐骨神经可在海马CA1区诱发出潜伏期固定,可重复出现的以负波为主的场电位;②对照组强直刺激后可出现持续时间2 h以上的LTP现象;③大、中、小剂量的Z-VAD-FMK抑制了强直刺激后海马CA1区LTP,主要表现在场电位幅度的变化,而且呈现剂量依赖性。结论LTP是学习与记忆的神经基础,Z-VAD-FMK能抑制海马LTP的诱导和形成且呈现剂量依赖性。

caspase抑制剂z-VAD-fmk对阿霉素损伤乳鼠心肌细胞calumenin、caspase-3、GRP78及GRP94表达的影响

目的:研究细胞凋亡限速酶caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk对阿霉素损伤心肌细胞calumenin、caspase-3、GRP78及GRP94表达的影响,探讨心肌细胞网腔钙结合蛋白与内质网应激及心肌细胞凋亡是否存在相互调控关系。方法:原代培养乳鼠心肌细胞实验分为3组:对照组(正常细胞)、阿霉素组(3 mg/L阿霉素+心肌细胞)、ZVAD-fmk组(3 mg/L阿霉素+0.1μmol/L Z-VAD-fmk+心肌细胞),每组细胞设3个复孔,分别处理后置37℃、CO2培养箱中培养24 h阿霉素组、z-VAD-fmk组。采用免疫组化方法检测培养乳鼠心室肌细胞α-SMA蛋白。采用Western blot技术检测各组心肌细胞Calumenin、内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94及caspase-3表达。结果:与对照组相比较,阿霉素组心肌细胞calumenin表达明显减少(P<0.01),GRP78、GRP94及caspase-3表达增加(P<0.01)。与阿霉素组相比较,z-VAD-fmk组心肌细胞calumenin表达增加(P<0.01),而GRP7,GRP94及caspase-3减少(P<0.01)。结论:caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk增加阿霉素损伤心肌细胞calumenin表达进而缓解内质网应激。

凋亡抑制剂Z-VAD-FMK在猪卵母细胞冷冻保存中的应用

在猪MII期猪卵母细胞冷冻解冻后的孵育液中添加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK,通过检测线粒体膜电位、早期凋亡、胚胎发育和相关基因表达等研究Z-VAD-FMK对冷冻后卵母细胞的影响。结果表明:(1)冷冻后线粒体膜电位(0.91)与新鲜卵母细胞(1.33)相比显著降低,添加Z-VAD-FMK显著提高了线粒体膜电位(1.19);(2)冷冻后卵母细胞的早期凋亡率(57.65%)与新鲜卵母细胞(8.37%)相比显著升高,存活率(61.45%)、孤雌激活卵裂率(13.18%)和囊胚率(3.10%)与新鲜卵母细胞(98.97%、89.41%和41.40%)相比显著下降,冻后孵育液中添加Z-VAD-FMK处理能显著降低其早期凋亡率(32.82%),并显著提高其存活、孤雌激活卵裂和囊胚的发育能力(73.21%、39.83%和10.79%);(3)冷冻后死亡受体途径和线粒体途径中促凋亡基因表达显著增加,抗凋亡基因表达显著降低,加入Z-VAD-FMK后促凋亡基因表达显著下降,抗凋亡基因表达显著增加。总之,在冻后孵育液中添加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK能提高卵母细胞膜电位水平,降低细胞凋亡和相关基因表达,从而达到提高冻后猪卯母细胞体外发育能力的目的。

z-VAD-fmk对烫伤大鼠肾脏细胞凋亡的影响

目的探讨广谱半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)抑制剂z-VAD-fmk对烫伤大鼠肾脏细胞凋亡的影响。方法 48只雄性Wistar大鼠制作严重烫伤模型并随机分为治疗组与对照组各24只。z-VAD-fmk首次剂量3 mg/kg,此后每隔12 h腹腔注射1.5 mg/kg;对照组用等剂量生理盐水干预。两组分别于造模后2、8、24、48 h各处死6只大鼠,取出肾脏。采用TUNEL法检测肾脏细胞凋亡指数(AI),免疫组化法检测B淋巴细胞瘤/白血病-2(bcl-2)和Bcl-2同源拮抗蛋白/致死蛋白(Bax)表达,荧光比色法检测Caspase-3活性。结果与对照组比较,治疗组造模8、24、48 h AI水平降低、Bax表达水平降低、Bcl-2表达水平升高(P均<0.05)。两组Caspase-3活性均于伤后8 h达峰值;与对照组比较,治疗组造模2、8、24、48 h Caspase-3活性均降低(P均<0.05)。结论 z-VAD-fmk可抑制烫伤大鼠早期肾脏细胞的凋亡,其作用机制可能为下调AI、Bcl-2表达水平、Caspase-3活性,上调Bax表达。

z-VAD-fmk对吸入性损伤小鼠肺脏细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响

目的:观察广谱caspase抑制剂(z-VAD-fmk)对吸入性损伤小鼠肺脏细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响。方法:72只BALB/c小鼠造模后随机分为对照组与治疗组各36只,每组设2、6、12、24、48、72 h共6个相应时段,每时段6只,治疗组腹腔给予z-VAD-fmk 6mg/kg,对照组用生理盐水代替,分别于上述各时段剖胸取肺,行常规病理切片并用免疫组化方法观察Bcl-2和Bax表达的变化,计算各时相点肺脏细胞凋亡指数(AI)。结果:小鼠吸入性损伤6 h后,与对照组相比,治疗组AI降低,Bax表达减弱,Bcl-2表达增强,差异具有统计学意义(P<0.05),12 h后差异具有显著性(P<0.01)。结论:小鼠吸入性损伤后,z-VAD-fmk可以增强Bcl-2表达及减弱Bax表达,抑制肺脏细胞凋亡。

顺铂诱导TNF-α自分泌引发头颈部鳞状癌细胞RIP1/RIP3/MLKL的坏死性凋亡

目的探讨顺铂是否能够诱导头颈部鳞状癌细胞产生TNF-α,进而激活RIP1/RIP3/MLKL依赖性的坏死性凋亡通路,抑制鳞癌细胞的增殖,并探讨其分子机制。方法选取头颈部鳞状癌细胞系HN4和SCC4作为实验对象,分为对照组、顺铂组、caspases抑制组、坏死性凋亡抑制组。利用CCK-8法检测顺铂刺激后24 h的细胞存活率。随后采用Western blotting检测caspase-8以及坏死性凋亡通路蛋白(RIP1/RIP3/MLKL)和NF-κB(p65)、TNF-α表达情况;结合细胞划痕实验和Western blotting检测上皮间充质转化相关蛋白(N-cadherin、Vimentin、E-cadherin)的表达情况,评估坏死性凋亡对头颈部鳞状癌细胞迁移能力的影响。结果顺铂对HN4、SCC4细胞毒性IC_(50)分别约为10μg/mL、15μg/mL。在顺铂刺激下,与坏死性凋亡抑制剂组相比,caspase-8表达降低(P<0.05),N-cadherin、Vimentin表达降低(P<0.05)、E-cadherin表达升高(P<0.05),坏死性凋亡通路蛋白(RIP1/RIP3/MLKL)表达升高(P<0.05),TNF-α和NF-κB(p65)蛋白表达均升高(P<0.05)。在顺铂组中,细胞愈合率显著降低于对照组和坏死性凋亡抑制剂组。结论顺铂作用可激活头颈部鳞状癌细胞NF-κB信号通路,并促进TNF-α自分泌,从而引发鳞癌细胞经由RIP1/RIP3/MLKL通路依赖性的坏死性凋亡反应,并抑制肿瘤细胞性增殖。

缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞Necroptosis模型的建立

目的:采用拟缺血再灌注损伤结合z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone,z-VAD-FMK)干预,探索一种脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)Necroptosis模型。方法:首先利用原代大鼠脑微血管内皮细胞,采用氧糖剥夺及复氧复糖方法,筛选出拟缺血再灌注损伤时间点。在拟缺血再灌注模型基础上,予Casepase抑制剂z-VAD-FMK 20μmol/L干预,采用CCK-8检测细胞活性;透射电镜观察细胞超微结构;Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)双染色法检测细胞死亡方式。结果:确定氧糖剥夺2 h复氧复糖8 h,作为拟缺血再灌注时间点;z-VADFMK作用于拟缺血再灌注损伤BMECs后,细胞活性无统计学意义;z-VAD-FMK干预组在电镜下呈现明显的Necroptosis特征;流式检测显示,各象限细胞比率无明显变化,但Necroptosis特异性抑制剂Nec-1可显著降低Q2象限细胞比率,提示z-VAD-FMK干预抑制了细胞晚期凋亡,诱导了Necroptosis的发生。结论:z-VAD-FMK可诱导拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞发生Necroptosis,为以后研究缺血性脑中风necroptosis机制提供了细胞实验模型。

黄芩苷诱导小鼠结肠癌发生坏死性凋亡作用的体外研究

目的探讨黄芩苷对小鼠结肠癌CT26.WT细胞的作用及细胞死亡形式。方法 CT26.WT细胞分为4组,(1)正常对照组,加入新鲜培养基,常规培养;(2)黄芩苷组,加入终浓度为100μmol·L-1黄芩苷;(3) z-VAD-fmk组,加入终浓度为20μmol·L-1z-VAD-fmk;(4)联合用药组,加入终浓度为20μmol·L-1z-VAD-fmk 1 h后加入100μmol·L-1黄芩苷。采用CCK8法检测黄芩苷对细胞增殖抑制作用和细胞存活率。DAPI染色检测细胞核的变化;透射电镜观察细胞超微结构; QPCR法和Western blotting法检测黄芩苷对细胞内RIP3基因和蛋白表达水平的影响。结果与正常对照组比较,黄芩苷组和联合用药组差异有统计学意义(P<0.05);正常对照组细胞死亡率为(10.54±0.19)%,黄芩苷组为(34.93±0.16)%,z-VAD组为(11.23±0.59)%,联合用药组为(23.27±1.20)%(P<0.01)。与正常对照组比较,黄芩苷组核浓染,出现碎裂现象;与黄芩苷组比较,联合用药组核浓染,有明显核碎裂现象。电镜结果显示黄芩苷组细胞发生坏死性凋亡,细胞肿胀,线粒体肿胀,内容物泄漏。黄芩苷组RIP3 mRNA的表达明显上调(P<0.01),RIP3蛋白的表达明显增强(P<0.05)。结论黄芩苷诱导CT26.WT细胞发生坏死性凋亡,可使RIP3的基因和蛋白表达明显上调。

氯化钴对PC12细胞的凋亡作用

目的 确定氯化钴(CoCl2 )对PC12细胞的影响。方法 构建CoCl2 诱导的PC12细胞模型,检测CoCl2 对PC12细胞的毒性作用;将Caspases的抑制基因p3 5转染PC12细胞得到可稳定表达p3 5基因的细胞株PC12 p3 5 ,检测p3 5对CoCl2 诱导的PC12细胞的作用;检测Caspases特异性多肽抑制剂Z VAD FMK对CoCl2 诱导的PC12细胞的作用。结果 分别以10 0、3 0 0、5 0 0、70 0和10 0 0 μmol LCoCl2 诱导PC12细胞2 4h或以5 0 0 μmol LCoCl2 分别诱导PC12细胞12、2 4、3 6、48和60h后,PC12细胞存活率均明显下降(P <0 0 1) ,并与CoCl2 诱导的时间和浓度呈正相关;细胞亚显微结构检测,流式细胞分析和DNA片段化结果也表明5 0 0 μmol LCoCl2 诱导PC12细胞2 4h可使PC12细胞出现明显凋亡特征。构建可稳定表达Caspase蛋白酶抑制基因p3 5的PC12细胞株,或分别加入5 0和10 0 μmol LCaspases多肽抑制剂Z VAD FMK预处理PC12细胞1h后,以5 0 0 μmol LCoCl2 诱导PC12细胞2 4h ,形态学观察结果,细胞存活率检测和流式细胞分析均表明p3 5基因和Z VAD FMK均可有效地抑制CoCl2 诱导的PC12细胞凋亡(P <0 0 1)。结论 CoCl2 可诱导PC12细胞凋亡。

PARP-1/AIF通路在大鼠实验性蛛网膜下腔出血后早期细胞凋亡中的作用和意义

目的探讨在大鼠实验性蛛网膜下腔出血(SAH)模型应用Caspase抑制剂后,海马区细胞多聚(腺苷二磷酸2核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)-polymerase 1,PARP-1]/凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)凋亡途径的变化。方法将64只SD大鼠分为空白对照组、模拟手术组、非抑制组[SAH+DMSO(24、48、72 h)]和抑制组[SAH+Z-VAD-FMK(24、48、72 h)],采用单次视交叉池注血模型建立大鼠SAH。抑制组用广谱caspases抑制剂Z-VAD-FMK行大鼠右侧脑室缓慢注射。各时间点标本用多聚甲醛灌注处理;免疫组化测定海马组织Caspase3、PARP-1和AIF表达;TUNEL检测海马组织细胞凋亡程度。比较各组Caspase3、PARP-1和AIF蛋白表达及细胞凋亡。结果抑制组大鼠PARP及AIF均较其它各组表达强(P<0.05);抑制组大鼠海马组织细胞凋亡较非抑制组减轻(P<0.05),高于空白组和模拟手术组(P<0.05),提示细胞凋亡未得到满意抑制。结论在Caspase凋亡途径被抑制情况下,SAH后早期脑细胞凋亡可能主要由PARP-1/AIF通路可能介导。

非洲爪蟾卵无细胞凋亡体系的建立

目的 建立一种简便、高效的无细胞凋亡体系 ,探讨外源细胞核在其中的凋亡过程及z VAD fmk对其的抑制作用。方法 超速离心制备非洲爪蟾卵无细胞体系 ,用细胞色素C激活为凋亡体系。应用荧光显微镜、琼脂糖凝胶电泳、ApoAlertCaspase 3ColorimetricAssay等方法检测外源细胞核在无细胞凋亡体系中的凋亡过程及z VAD fmk的抑制作用。结果 制备的爪蟾卵无细胞体系可由细胞色素C激活为凋亡体系 ,外源加入的细胞核呈现典型的形态学变化 ,总DNA特异降解形成DNAladder。体系内内源特异核酸酶被激活。z VAD fmk可抑制DNAladder的形成。凋亡特异蛋白酶XCPP32活性明显升高。结论 本实验建立的无细胞凋亡体系可以高效的诱导外源细胞核凋亡 ,重现体内过程。

延迟注射Z-VAD对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及炎症的影响

目的探讨延迟注射Caspase抑制剂Z-VAD-fmk对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡和炎症的影响。方法采用大鼠大脑中动脉局灶性脑梗死动物模型(MCAo),60只健康Wistar大鼠分为Z-VAD-fmk治疗组和生理盐水对照组。脑血流再通30min后侧脑室注射Z-VAD-fmk(70μg/kg),对照组注射同体积的生理盐水,分别在MCAo术后第1天、第4天、第7天处死各组动物,采用TUNEL染色检测凋亡细胞,ED-1染色检测巨噬细胞和活化的小胶质细胞。结果 TUNEL染色阳性细胞在术后第1天开始Z-VAD-fmk治疗组比对照组明显减少(P<0.05),ED-1染色阳性细胞从第4天开始有明显下降(P<0.05)。结论延迟注射Z-VAD-fmk可以减少细胞凋亡,同时也减少炎症的发生。

Caspases抑制条件下5-FU诱导乳腺癌细胞发生坏死性凋亡的作用

目的探讨5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用,并在抑制caspases的条件下,对5-FU诱导的乳腺癌细胞的死亡形式进行探讨。方法 MTT法检测不同浓度的5-FU(0,4,8,16,24,32μmol/L)对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,筛选适宜的药物浓度。在适宜药物浓度下实验分为对照组、z-VAD-fmk组、5-FU组、5-FU+zVAD-fmk组,MTT法检测乳腺癌细胞存活率;PI单染流式细胞术检测乳腺癌细胞的死亡率;DAPI染色检测乳腺癌细胞核的变化;透射电镜观察乳腺癌细胞的死亡形式;Western blot检测坏死性凋亡蛋白RIP1表达的变化。结果 8μmol/L为5-FU的适宜浓度,该浓度下MDA-MB-231细胞在24 h,48 h,72 h的存活率分别为(68.94±1.17)%,(48.76±1.47)%和(44.15±2.41)%。MTT、PI、DAPI实验结果表明与对照组和5-FU组相比,5-FU+z-VAD-fmk组细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞核浓染加深,核固缩现象显著。电镜结果显示5-FU组细胞发生凋亡,5-FU+z-VAD-fmk组细胞发生坏死性凋亡。Western blot结果表明:z-VAD-fmk联用时5-FU明显上调RIP1蛋白的表达。结论 5-FU可以诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡;caspases抑制条件下5-FU通过激活RIP1诱导MDA-MB-231细胞发生坏死性凋亡。