痛泻要方对肝郁脾虚型UC大鼠结肠组织Claudin-1、ZO-1及血清COX-2、iNOS表达的影响

目的:探讨痛泻要方对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型大鼠血清中环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)含量及结肠组织中密封蛋白1(Claudin-1)、紧密连接蛋白1(ZO-1)基因及蛋白表达的影响。方法:100只Wistar大鼠用病-证结合法复建肝郁脾虚型UC模型,按随机数字表法将造模组大鼠分为模型组(10 g/kg蒸馏水灌胃),美沙拉嗪组(0.4 g/kg美沙拉嗪灌胃),痛泻要方高、中、低剂量组(20.8、10.4、5.2 g/kg痛泻要方灌胃),每组20只。另取20只正常大鼠作为空白组(10 g/kg蒸馏水灌胃),各组灌胃体积均为10 mL/kg,连续21 d。药物治疗结束后,取血清及结肠组织,ELISA法检测血清中COX-2、iNOS含量;观察结肠组织大体形态及损伤情况,HE染色观察病理表现,RT-qPCR法检测Claudin-1、ZO-1 mRNA表达,免疫组化法和Western blot法检测Claudin-1、ZO-1平均光密度值及蛋白表达。结果:光镜观察显示,模型组大鼠结肠黏膜充血、水肿,炎性细胞浸润,细胞间紧密连接断裂;经痛泻要方干预后,大鼠结肠黏膜病理变化明显改善,细胞间紧密连接正常。与空白组比较,模型组大鼠血清中COX-2、iNOS含量明显升高(P<0.01);Claudin-1、ZO-1 mRNA、平均光密度值和蛋白表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较,美沙拉嗪组COX-2、iNOS含量降低(P<0.01);痛泻要方高、中剂量组COX-2、iNOS含量显著降低(P<0.01),痛泻要方低剂量组COX-2、i NOS含量降低(P<0.05);美沙拉嗪组及痛泻要方高、中剂量组Claudin-1、ZO-1 mRNA平均光密度值及蛋白表达量显著升高(P<0.01);痛泻要方低剂量组Claudin-1、ZO-1 mRNA表达量与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05);痛泻要方低剂量组Claudin-1、ZO-1平均光密度值升高(P<0.05),蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05)。结论:痛泻要方治疗肝郁脾虚型UC的作用可能与上调关键蛋白Claudin-1、ZO-1的表达量及降低炎症细胞因子COX-2、iNOS的含量有关。

NE激活Nrf2/HO-1信号通路调节人子宫内膜上皮细胞的氧化应激

目的明确去甲肾上腺素(NE)是否能通过核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)调控培养的人子宫内膜上皮细胞(hEECs)的氧化应激状态。方法培养hEECs,通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测α和β肾上腺素能受体在hEECs的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)实验确定NE处理对细胞活性的影响,根据结果将细胞分为处理组和对照组,选择合适浓度进行处理;通过Western blot实验,检测闭锁蛋白(Occludin),闭锁小带蛋白-1(ZO-1),凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),抗氧化应激蛋白Nrf2、HO-1的表达,流式细胞术检测NE处理后细胞凋亡的情况;酶联免疫吸附试验试剂盒(ELISA)检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平。结果在hEECs上检测到α1 a、α1 b、α2 a、α2 b、α2 c、β1、β3肾上腺素能受体的表达。NE处理后,在低浓度(5、10μmol/L)不明显影响细胞活力,而15、20μmol/L NE处理细胞6 h或24 h均明显增加细胞活性。紧密连接蛋白ZO-1和Occludin在15μmol/L 24 h处理组显著升高。ZO-1在6 h处理组下降,15μmol/L处理显著下降,同时Occludin在6 h处理组升高。NE处理后与对照相比,细胞凋亡率升高,15μmol/L NE处理细胞6 h凋亡率显著升高,处理24 h后细胞凋亡率有所下降,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax>1。NE处理后,上调Nrf2及HO-1,细胞培养基上清液中的MDA水平没有明显升高,同时SOD水平明显上调。结论NE处理细胞后可通过激活Nrf2/HO-1信号,上调SOD,发挥抗氧化应激、抗凋亡的作用。

水稻单C_2H_2型锌指基因ZOS2-01的表达与功能分析

拟南芥超雄基因(SUPERMAN,SUP)是一个单C2H2锌指基因。该基因突变后会造成雌蕊同源转化为雄蕊,正常的心皮发育受阻,因此SUP在控制花第3/4轮边界的建立和胚珠的发育中起重要作用。为了探知水稻中的SUP同源基因是否也存在类似的功能,我们根据拟南芥SUP的功能结构域,从水稻中克隆了一个与SUP类似基因,命名为ZOS2-01,并对其表达和功能进行了分析。结果表明,ZOS2-01与拟南芥的SUP和矮牵牛的PhSUP1在系统进化树上处于同一分支且与SUP的功能结构域完全相同。定量PCR和GUS表达分析表明,除胚乳外,ZOS2-01几乎在所有组织和器官中表达,但在幼穗中的表达量最高,暗示它可能参与了水稻的营养生长和花器官发育的调节。然而,采用RNA干扰和过量表达的方法减少和增加ZOS2-01的表达并没有明显影响水稻的生长发育,转基因水稻的营养生长正常,花器官发育也没有明显异常且结实正常。这些结果表明,尽管水稻ZOS2-01与拟南芥SUP具有相同的功能结构域,但它们的表达和功能可能已出现了分化,或者水稻中存在多个功能冗余的SUP类似基因。

糖肾煎对早期2型糖尿病肾病大鼠足细胞α-actinin-4、ZO-1表达的影响

目的:探讨α-辅肌动蛋白-4(α-actinin-4)、紧密连接蛋白(ZO-1)在早期糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏表达与DN的关系,中药糖肾煎对保护肾脏的作用机制。方法:采用单肾切除+高脂饲料+小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射,结合行为干预建立早期(气阴两虚型)2型糖尿病肾病病证结合大鼠模型,按随机数字表法分为假手术组(N组)、模型组(M组)、糖肾煎组(T组)、贝那普利组(B组)。干预16周,观察各组大鼠一般状况、空腹血糖(FBG)、负荷后血糖(P2h BG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、24 h尿白蛋白(24 h-UAlb)、尿β2微球蛋白(U-β2MG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr))、足细胞密度及病理改变,应用免疫组化及荧光定量PCR方法观察α-actinin-4、ZO-1及mRNA表达。结果:与N组比较,M组一般状况较差,FBG、P2h BG、FINS、HOMA-IR、24 h-UAlb、U-β2MG水平指标均有明显上升,α-actinin-4、ZO-1的累积光密度值(IOD)下降,PCR表达下降,足细胞密度较少,足突增宽、融合;与M组比较,T、Z组各指标均有改善;与B组比较,T组HOMA-IR、α-actinin-4、ZO-1的IOD有所改善,余指标比较差异无统计学意义。结论:中药糖肾煎能上调足细胞α-actinin-4、ZO-1的表达从而保护足细胞、延缓DN的进展。

细胞粘附蛋白、HER-2、ZO-1和VEGF与弥漫型胃癌侵袭转移的相关性研究

目的研究细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、紧密连接蛋白1 (zonula oc-cludens-1,ZO-1)和人表皮生长因子受体-2 (human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)与胃癌侵袭转移的相关性研究。方法选取弥漫型胃癌患者60例,收集患者胃癌组织、癌旁组织(距癌2 cm)和远离胃癌的正常组织(距癌5 cm),采用Real-Time PCR和免疫组化法检测患者组织中ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA表达水平的表达。免疫组化法检测患者组织中ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2蛋白表达水平。结果与对照组和癌旁组织ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA表达水平相比,胃癌组患者癌组织内ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2 mRNA表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P <0. 05)。免疫组织化学法结果显示,ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2阳性表达和弥漫型胃癌的淋巴结转移、浸润深度和TNM分期具有明显的相关性,差异具有统计学意义(P <0. 05)。ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2阳性表达和弥漫型胃癌患者的年龄、性别和肿瘤直径没有相关性,差异不具有统计学意义(P> 0. 05)。结论 ICAM-1、VEGF、ZO-1和HER-2与弥漫型胃癌的侵袭转移存在明显的相关性,可作为判断胃癌侵袭转移能力的有效指标。

LIM蛋白KyoT2与人类紧密连接蛋白2的相互作用

KyoT是一种LIM结构域蛋白 ,是以RBP J为诱饵蛋白通过酵母双杂交系统得到的新分子。KyoT2可以抑制RBP J介导的转录。以KyoT2为诱饵蛋白 ,通过酵母双杂交筛选得到了人类紧密连接蛋白 2 (ZO 2 )的一种新的剪接体ZO 2 i3。序列分析表明 ,新的剪接体有 19个外显子 ,与已发表序列比较 ,见ZO 2 i3分子的激酶后区发生了改变。为排除酵母双杂交实验的假阳性 ,实验首先在酵母中验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用并得到阳性结果。进而在大肠杆菌中原核表达纯化带有His标签的KyoT2蛋白 ,使用抗His标签的抗体 ,通过GSTpull downassay验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用 ,也获得阳性结果。并通过酵母实验初步确定了其作用位点 ,即KyoT2通过LIM2结构域与ZO 2 i3相互作用。本实验验证了KyoT2与ZO 2 i3的相互作用 ,并初步确定其相互作用位点 ,对探讨KyoT的功能具有重要意义。

淫羊藿苷对阿尔茨海默病大鼠模型金属蛋白酶及紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

目的探讨淫羊藿苷对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)大鼠学习记忆、海马区基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2及血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1表达的影响。方法采用Aβ1-42海马注射建立AD大鼠模型,使用淫羊藿苷进行干预。以Morris水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力,采用Western-blot法分析紧密连接蛋白ZO-1的表达,用免疫组织化学法检测大鼠海马区MMP-9、MMP-2表达。结果与对照组相比,AD模型组大鼠学习记忆能力明显减退,ZO-1表达明显减少(P<0.05),MMP-9、MMP-2蛋白明显增加;淫羊藿苷干预后,大鼠学习记忆能力均明显提高,海马区MMP-9/MMP-2表达减少(P<0.05),ZO-1表达明显增加(P<0.05),以淫羊藿苷高剂量干予后明显。结论淫羊藿苷能通过抑制MMP-9/MMP-2表达,减轻血脑屏障破坏,从而改善AD症状。

电刺激迷走神经对脓毒症小鼠肠道通透性的作用及机制研究

目的探讨电刺激迷走神经对脓毒症小鼠肠道通透性的作用及机制。方法将50只C57BL/6小鼠随机分为对照组(CON组)、脓毒症组[脂多糖(LPS)组]、迷走神经切断组(VGX组)、电刺激迷走神经组(STM组)、α-银环蛇毒素(α-BGT)组,每组10只。LPS组、VGX组、STM组、α-BGT组均腹腔注射10 mg/kg LPS制备脓毒症模型,CON组则腹腔注射等体积生理盐水。CON组、LPS组仅暴露双侧颈迷走神经,VGX组、STM组、α-BGT组均切断双侧颈迷走神经,STM组电刺激左颈迷走神经,α-BGT组皮下注射α-BGT后再电刺激左颈迷走神经。处死各组小鼠后取回肠组织,光镜下进行组织病理学观察,评估肠道组织通透性,并检测紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-2)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和核因子-κB(NF-κB)蛋白相对表达量。结果LPS组小鼠回肠组织肠黏膜上皮细胞损伤严重,微绒毛坏死、脱落,大量炎性细胞浸润,VGX组回肠组织病理学改变程度较LPS组加重,STM组回肠组织病理学改变程度较LPS组、VGX组减轻,α-BGT组肠黏膜上皮细胞损伤最严重。与CON组比较,LPS组、VGX组小鼠肠上皮组织通透性均增加,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组、VGX组比较,STM组小鼠肠上皮组织通透性降低,差异有统计学意义(P<0.05);与STM组比较,α-BGT组小鼠肠上皮组织通透性增加,差异有统计学意义(P<0.05)。LPS组、VGX组小鼠肠上皮组织中ZO-1、claudin-2蛋白相对表达量低于CON组,STM组小鼠肠上皮组织中ZO-1、claudin-2蛋白相对表达量高于LPS组、VGX组,α-BGT组小鼠肠上皮组织中ZO-1、claudin-2蛋白相对表达量低于STM组,差异均有统计意义(P<0.05)。LPS组、VGX组小鼠肠上皮组织中MLCK、NF-κB蛋白相对表达量高于CON组,STM组小鼠肠上皮组织中MLCK、NF-κB蛋白相对表达量低于LPS组、VGX组,α-BGT组小鼠肠上皮组织中MLCK、NF-κB蛋白相对表达量高于STM组,差异均有统计意义(P<0.05)。结论电刺激迷走神经有助于保护脓毒症小鼠的肠道屏障功能,其潜在机制或与激活胆碱能抗炎通路,进而抑制炎症反应相关。

2－（3，5－二氯－2－吡啶偶氮）－5－二甲氨基苯胺与铂（Ⅳ）显色反应的研究

研究了２－（３，５－二氯－２－吡啶偶氮）－５－二甲氨基苯胺与铂（Ⅳ）的显色反应，在ｐＨ３．５～６．０醋酸－醋酸钠介质中，沸水浴加热２５ｍｉｎ，试剂与铂（Ⅳ）形成１：４的紫色配合物，再提高酸度至２．９～４．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液，其最大吸收峰红移至６３０ｎｍ，灵敏度显著提高，表现摩尔吸光系数ε＿（６００）＝７．０×１０￣４Ｌ·ｍｏｌ￣（－１）·ｃｍ￣（－１），铂含量在０～３２μｇ／２５ｍＬ范围内符合比耳定律。大多数常见金属离子不干扰测定，所拟方法操作简便，用于催化剂中微量铂的测定。

35kDa透明质酸调控蛋白ZO-1和Claudin-2治疗新生小鼠坏死性结肠炎

目的探讨35kDa透明质酸对新生小鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)的影响及可能机制。方法新生8日龄的C57BL/6J小鼠30只随机分为对照组、NEC模型组与NEC+HA35组,每组10只,建模3d后处死。HE染色观察各组小鼠肠组织病理学改变;酶联免疫吸附实验检测各组小鼠血清炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平;蛋白免疫印迹法检测各组小鼠肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-2的表达;实时荧光定量PCR检测各组小鼠肠组织中ZO-1 mRNA和Claudin-2 mRNA的表达。结果与对照组相比,模型组小鼠血清IL-6和TNF-α的表达水平明显升高,肠组织中ZO-1和Claudin-2的表达明显下调(P<0.05)。35kDa透明质酸能够降低模型组小鼠血清IL-6和TNF-α的表达水平,上调肠组织中ZO-1和Claudin-2的表达(P<0.05)。结论35kDa透明质酸能够减轻新生小鼠坏死性小肠结肠炎的炎症反应,机制可能与调控ZO-1和Claudin-2的表达相关。

孕期开始的持续维生素A缺乏加重LPS诱导的仔鼠肠上皮屏障功能障碍

目的探讨孕期维生素A(VA)缺乏对LPS诱导的仔鼠肠上皮屏障功能障碍的影响。方法构建孕期开始的VA正常(VAN)和VA缺乏(VAD)母鼠模型,其子代(仔鼠)于6周龄时给予脂多糖(LPS)灌胃诱导肠道感染。高效液相色谱法(HPLC)检测血清视黄醇水平;ELISA试剂盒检测仔鼠血清二胺氧化酶(DAO)浓度;采用RT-PCR和Western blot技术测定RA受体(RARβ)、Toll样受体4和紧密连接蛋白ZO-2的变化。结果 VA营养水平与LPS处理均是血清视黄醇的影响因素(P<0.000 1和P=0.035 9),但影响血清视黄醇水平的主要因素是VA营养水平(P<0.000 1)。同时,VA水平与LPS处理也均是血清DAO水平的影响因素(P=0.048 1和P<0.000 1),但LPS是引起DAO水平升高的主要因素(P<0.000 1)。此外,VAD仔鼠结肠黏膜组织中的RARβ、TLR4和ZO-2的mRNA和蛋白表达水平均较VAN组显著降低。LPS处理后,RARβ的表达水平在VAN组进一步降低,VAD仔鼠结肠黏膜组织中TLR4和ZO-2的表达水平始终低于VAN组。结论孕期开始的持续的VA缺乏主要降低血清视黄酸水平及ZO-2的表达,LPS处理上调血清DAO水平及肠上皮细胞TLR4的表达,而RARβ的表达水平受到VAD及LPS的交互作用,提示VA缺乏可能会降低仔鼠肠道的天然免疫调节能力,降低肠道屏障功能,从而影响肠道的抗感染能力。

现场氧化锌避雷器阻性电流测试误差分析

通过ＬＣＤ—４型泄漏电流测试仪在现场的应用，就测量氧化锌避雷器阻性电流、全电流时造成的三相数据不平衡的原因进行了分析。发现测试的氧化锌避雷器三相数据相差较大，其基本规律为Ａ〉Ｂ〉Ｃ，并分析了产生这种误差的主要原因。通过大量实测数据总结出测量值的误差，并就环境温度对阴性电流的影响进行了分析，同时用曲线描述了氧化锌避雷器在不同环境温度下阴性电流的变化规律。

正交试验法测定痕量铁的研究——微晶石蜡柱固相萃取体系

本文成功地建立了以微晶石蜡柱为固相萃取剂,以2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚(5-Br- PADAP)为显色剂的固相革取光度法测定痕量铁的新方法,并采用正交试验法考查了测定条件。方法基于在 pH=4.5的缓冲溶液中,铁(Ⅱ)与5-Br-PADAP形成稳定的配合物,在λ=742nm处进行测定,其摩尔吸光 系数为:ε742=2.61×105L·mol-1cm-1,检测限为:0.218μg·L-1,铁含量在0-0.4μg·mL-1范围内服从比尔 定律。该方法用于水样中痕量铁的测定,结果满意。

竞争光度法配体竞争体系络合平衡的研究

本文利用竞争光度法，从直接测定配体之一的平衡浓度着手，基于溶液中物种分布关系，拟订了一个测定竞争体系络合物稳定常数的新方法。方法简便可靠，用于２－（５－溴－２－吡啶偶氮）－５－二乙胺基苯酚和邻菲啉竞争铅（Ⅱ）的体系获得满意的结果。

基于MAPK/ERK通路研究芍药汤对溃疡性结肠炎黏膜损伤修复作用机制

[目的]探讨芍药汤通过有丝分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signalregulated kinase,MAPK/ERK)通路对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)结肠黏膜损伤的修复作用和机制。[方法]经结肠缓慢推注5%三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)0.09 mL+无水乙醇0.06 mL,复制大鼠UC模型,将48只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)SD大鼠随机分为正常组,模型组,芍药汤高、中、低剂量组与美沙拉嗪组。各组灌胃干预,评价疾病活动指数(disease activity index,DAI),观察组织病理变化并进行组织学活动指数(histological activity index,HAI)评分;以实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)及免疫印迹法检测结肠组织中屏障保护相关指标的mRNA及蛋白表达水平。建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)小肠上皮细胞IEC-6损伤模型,以噻唑蓝比色法(dimethylthiahiazo,MTT)筛选药物最佳干预浓度,将细胞分为空白组、LPS组和芍药汤组,划痕实验观察细胞迁移率;免疫印迹法检测细胞闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)蛋白表达水平。[结果]体内实验显示,与正常组比较,模型组大鼠肠黏膜结构缺失,黏膜下层和固有层可见明显的炎性细胞浸润;DAI、HAI评分显著升高(P<0.01),紧密连接蛋白-2(claudin-2)、磷酸化p38MAPK(phosphorylatedp38MAPK,p-p38MAPK)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated-ERK1/2,p-ERK1/2)蛋白表达显著下调(P<0.001,P<0.01,P<0.001);肠三叶因子(intestinal trefoil factor,ITF)的mRNA表达显著降低(P<0.05),缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白与mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,芍药汤各组病理损伤明显改善,DAI、HAI评分明显降低(P<0.05,P<0.01),芍药汤各组claudin-2、p-p38 MAPK、p-ERK1/2蛋白表达水平显著上调(P<0.05,P<0.01,P<0.001),ITF mRNA表达量显著上调(P<0.01);HIF-1α蛋白与mRNA表达水平显著下调(P<0.01)。体外实验显示,与空白组比较,LPS可明显抑制IEC-6细胞迁移(P<0.01),下调ZO-1蛋白表达(P<0.05)。与LPS组比较,芍药汤组细胞迁移率明显上升(P<0.05,P<0.01),ZO-1蛋白表达明显上调(P<0.05)。[结论]芍药汤对UC大鼠结肠黏膜损伤具有修复作用,其机制可能与激活MAPK/ERK通路,上调claudin-2、ZO-1,下调HIF-1α蛋白表达,促进肠黏膜上皮细胞迁移有关。

基于氮杂环羧酸配体的镍(Ⅱ)配合物的合成、结构及性能研究

以1,2-二-(2-1H-咪唑-4,5-二甲酸)苯(H6Phbidc)为配体,在120℃下通过与NiCl_2·6H_2O的自组装,制备了1个新的镍(Ⅱ)配合物[Ni(H_4Phbidc)·2H_2O]·2H_2O·[NH(CH_3)_2](I)。单晶X-射线衍射分析表明,配合物I为正交晶系,Pnma空间群、中心金属离子Ni(Ⅱ)处于1个六配位的八面体配位环境中。对配合物I的红外光谱、粉末衍射图谱、热稳定性以及固态荧光性能进行了研究。结果表明,配合物I在185℃时失去二甲胺、结晶水和配位水,Ni(Ⅱ)离子的存在可以淬灭配合物的荧光。

Caco-2建立肠黏膜屏障模型及其在通透性研究中的应用

目的利用Caco-2细胞建立体外肠黏膜屏障模型，系统评价并初步探讨其在炎症损伤后黏膜通透性改变中的应用。方法体外培养Caco-2细胞，接种于Transwell板上，每日观察细胞形态；自培养第5天起，隔日测细胞膜的跨上皮电阻（transepithelialelectricalresistance，TEER）；对于TEER值达标准的孔测定荧光黄透过率，进行透射电镜的完整性验证。应用培养21d的Caco-2细胞屏障，加入不同浓度（0、50、100、200nmoWL）的血小板活化因子（platelet—activatingfactor，PAF）孵育24h，光镜、电镜观察形态学改变，检测TEER和荧光黄透过率，应用间接免疫荧光和Westernblot观察ZO-1蛋白的分布及表达。结果Caco-2细胞单层TEER从第5～15天逐渐增加，在第15天已经达到600Ω·cm2，平台期保持至第21天；在此期间，细胞形成紧密单层，电镜下细胞呈高分化，细胞间形成紧密连接，绒毛整齐，极性形成；荧光黄透过量极低，体外肠上皮细胞屏障形成。加入PAF后，以100nmoVL对黏膜屏障通透性影响最大：电镜下见紧密连接结构破坏、断裂，细胞表面微绒毛脱落、稀疏；免疫荧光可见紧密连接的标志蛋白ZO-1荧光信号减弱，ZO-1环断裂，胞浆内可见阳性染色，提示其向膜下转移。此时，TEER值下降，荧光黄透过量明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01），与形态学改变规律一致；ZO—1蛋白表达亦降至最低，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。结论经形态学及细胞通透性验证，培养2～3周的Caco-2细胞可形成肠屏障模型，用于体外肠黏膜屏障的研究；PAF影响紧密连接相关蛋白的表达，破坏紧密连接结构，从而影响肠黏膜屏障通透性。

高压氧对缺血再灌注肠黏膜上皮Caco-2细胞间紧密连接的影响

目的 观察高压氧（HBO）对缺血再灌注（I/R）人类肠黏膜上皮Caco-2细胞间紧密连接（TJ）的影响.方法 培养单层人类大肠黏膜上皮细胞Caco-2,应用0.5 mmol/L丁基过氧化氢（t-buooh）诱导离体肠黏膜上皮细胞I/R损伤.按数字表法随机分为5组（每组8个培养孔）：对照组（N组）、I/R组、HBO预处理（HBO-P）组、缺血期HBO干预（HBO-I）组、再灌注期HBO干预（HBO-R）组.采用跨膜电阻抗检测法（TEER）检测肠道黏膜上皮细胞间紧密连接的开放程度并评价其通透性.用Rt-PCR检测细胞间紧密连接蛋白ZO-1转录水平.结果 TEER阻值N组最高,其次为HBO-P组,再次为HBO-R组,最后为HBO-I组.N组与其他各组差异均有统计学意义（P＜0.01）;HBO-P组阻值与I/R组、HBO-I组及HBO-R组的阻值比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;HBO-R组与I/R组、HBO-I组阻值比较差异有统计学意义（P＜0.05）;L/R组高于HBO-I组,且差异有统计学意义（P＜0.05）.ZO-I mRNA的Rt-PCR结果显示：与N组相比,其他各组ZO-1 mRNA含量均明显下降,且差异有统计学意义（P＜0.01）;HBO-P组ZO-1 mRNA含量均高于L/R组、HBO-R组及HBO-I组（P＜0.01）;HBO-R组ZO-1 mRNA含量高于I/R组和HBO-I组（P＜0.05）;HBO-I组与I/R组ZO-1 mRNA含量接近,差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 HBO干预具有保护单层Caco-2细胞TJ功能作用,抑制TJ开放,机制可能与维持TJ的骨架蛋白ZO-1有关.缺血期前和再灌注期给予HBO干预治疗显示有益结果,HBO预处理疗效最佳,缺血期给予HBO无效.

intermedin预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的相关修复基因的影响

目的探讨intermedin（IMD）预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤（IRI）修复再生过程中相关修复基因的影响。方法健康雄性Wistar大鼠144只，随机分为假手术组、IRI组、转染空质粒组和转染IMD组。动物右肾切除后，用超声微泡技术将质粒转染入左肾，1周后制作肾脏IRI模型。分别于再灌注后1d、2d、3d、4d、7d和14d留取肾组织标本。RT—PCR法检测肾组织Pax-2、ZO-1、Ncam、Wt-1和vimentin的mRNA表达变化；Western印迹法分析Pax-2、Wt-1和vimentin蛋白表达变化；ELISIA法检测ZO-1、Ncam的蛋白表达变化。结果（1）IRI组大鼠Pax-2、Zo—1、Ncam、Wt-1和vimentin的mRNA和蛋白的表达在IRI后1—3d增加，2d达到高峰，与假手术组相比差异有统计学意义（P〈0．05），4d后基本恢复。（2）在IRI后1～4d，转染IMD组上述的mRNA和蛋白表达与同时间点的假手术组、IRI组和转空质粒组相比差异均有统计学意义（均P〈0．05），其中2d达高峰。（3）在IRI后7d、14d，IRI组、转染空质粒组和转染IMD组上述指标的mRNA和蛋白表达和假手术组差异无统计学意义（均P〉．05）；在IRI后4d，IRI组和转空质粒组上述的表达较假手术组增高，但差异无统计学意义（P〉0．05）。（4）各时间点IRI组和转染空质粒组上述各指标差异均无统计学意义（P〉0．05）。（5）ELISA法检测的ZO-和Ncam蛋白表达变化趋势与RT—PCR及Western印迹法一致。结论IMD预处理可通过增加肾脏组织修复基因Pax-2、ZO-1、Ncam、Wt-1和vimentin的表达，从而对肾组织的修复和再生起到重要作用。

中药火把花根对油酸致急性肺损伤大鼠气道紧密连接蛋白表达的影响

【摘要】目的观察中药火把花根对急性肺损伤（ALI）大鼠支气管上皮紧密连接蛋白claudin-2和ZO-1表达的影响，探讨火把花根对ALI的保护机制。方法将24只健康成年清洁级雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组、ALI组、火把花根预处理组，每组8只。经尾静脉注射油酸0．04mL／kg复制大鼠ALI模型，对照组注射等量生理盐水（NS）；火把花根预处理组于制模前10d连续灌胃药物600mg·kg^-1·d^-1（2mL），对照组和ALI组灌胃等量NS。制模后4h取腹主动脉血、收集支气管肺泡灌洗液（BALF），测定血浆及BALF中蛋白含量，计算肺通透性指数（LPI）；处死大鼠取肺组织，测定肺湿／干质量（W／D）比值，苏木素-伊红（HE）染色后光镜下观察肺组织病理学变化，并进行肺损伤评分（LIS）；应用免疫组化法观察支气管黏膜上皮claudin-2和ZO-1的阳性表达及定位；应用蛋白质免疫印迹试验（WesternBlot）检测支气管黏膜上皮claudin-2和ZO-1的蛋白表达。结果镜下显示：与对照组比较，ALI组大鼠肺组织损伤明显，细胞水肿，细胞间连接结构紊乱，LIS、W／D及LPI均显著升高[LIS（分）：3．81±0．42比0．40±0．08，W／D：7．68±0．64比4．44±0．39，LPI：0．89±0．15比0．38±0．05，均P〈0．01]；claudin-2和ZO-1主要表达在支气管上皮细胞，且ALI组表达强度较对照组明显减弱；WesternBlot显示，ALI组claudin-2和ZO-1的蛋白表达较对照组显著下调[claudin-2蛋白（灰度值）：0．43±0．31比2．16±1．33，ZO-1蛋白（灰度值）：1．25±0．41比2．82±0．76，均P〈0．01]。与ALI组比较，火把花根预处理可明显改善ALI大鼠肺损伤程度[LIS（分）：1．22±0．39比3．81±0．42，W／D：4．62±0．84比7．68±0．64，LPI：0．46±0．07比0．89±0．15，均P〈0．01]，且elaudin-2和ZO-1的蛋白表达均明显上调[elaudin-2蛋白（灰度值）：2．98±0．91比0．43±0．31，ZO-1蛋白（灰度值）：2．35±0．51比1．25±0．41，均P〈0．01]。结论火把花根可能通过上调支气管上皮细胞紧密连接蛋白claudin-2及ZO-1的表达，以减轻ALI时气道上皮损伤，从而起到肺脏的保护性作用。