骨髓增生异常综合征患者ZO-1基因甲基化状态检测的临床意义

本研究探讨紧密连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)基因异常甲基化在骨髓增生异常综合征(MDS)诊断中基因标志作用的临床意义。采用甲基化特异性-PCR(MS-PCR)方法分析30例健康人骨髓标本及85例MDS患者骨髓标本的ZO-1基因启动子区甲基化状况。结果显示:ZO-1基因在30例健康人标本中均呈完全非甲基化状态;MDS患者骨髓中ZO-1基因甲基化阳性率(56.5%)明显高于健康人,二者差异有统计学意义(p<0.05)。MDS各亚型病人骨髓ZO-1基因启动子区甲基化阳性率均高于健康人,其差异也具有统计学意义(p<0.05)。MDS亚型RA、RAS、RAEB、RCMD间ZO-1基因甲基化阳性率差别无统计学意义(p>0.05)。结论:与健康人相比,MDS病人骨髓中ZO-1基因启动子区呈高甲基化状态并具有特异性。MDS是一种常见的克隆增殖性血液系统疾病,在临床诊断中有时很难与其他疾病相鉴别,而ZO-1基因甲基化模式的改变与MDS的发生密切相关,因此ZO-1基因作为有价值的诊断标志具有重要的临床意义,它可能是一个潜在的血液系统恶性疾病的相关基因。

Zo-1与id4基因异常甲基化在多发性骨髓瘤中的临床意义

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是浆细胞恶性增殖性疾病,常规化疗不能治愈,为探讨zo-1、id4基因异常甲基化在MM诊断、预后、微小残留病检测及治疗中基因标志作用的临床意义,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MS-PCR)方法检测MM细胞系U266、H929及IM9(B淋巴母细胞,MM患者骨髓来源)中zo-1、id4基因的甲基化状况;应用MS-PCR方法分析20例MM患者及6例健康供者骨髓标本zo-1、id4基因启动子区甲基化状况。结果显示:zo-1、id4基因在MM细胞系中均为甲基化阳性(完全甲基化或部分甲基化);zo-1、id4基因在5例健康人标本中均呈完全非甲基化状态;MM患者骨髓中zo-1、id4基因甲基化阳性率分别是50%和85%,二者阳性覆盖率高达95%,二者均阳性的标本阳性率为40%,明显高于健康人(0%),差异均有统计学意义(p<0.05);MM患者不同重链及不同轻链间甲基化阳性率没有统计学差异;MM患者是否具有B组症状并不影响患者的甲基化阳性率,这可能与标本数量有关。结论:MM患者中zo-1、id4基因甲基化状态发生改变并具有特异性,可能是MM新的基因标记。

ZO-1基因甲基化在MDS进展中的意义

目的:探讨ZO-1基因甲基化在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)转化中的临床意义,为MDS患者的预后评估进一步提供理论依据。方法:采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)方法检测ZO-1基因在正常对照者骨髓标本(normal control,NC)、MDS、AML患者骨髓标本中的甲基化状态。运用亚硫酸氢盐侧序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)方法检测1例MDS系列标本ZO-1基因在其MDS-RA、MDS-RAEB、AML阶段的甲基化状态。结果:ZO-1基因在NC、MDS、AML患者标本中的甲基化阳性率存在明显差异(P=0.000),在NC组未发现甲基化阳性,在AM L组阳性率最高(65.0%)。MDS/AML患者ZO-1基因甲基化阳性组髓系原始细胞比例更高(P=0.000)。1例MDS患者系列标本显示,随着疾病进展,在MDS-RA、MDS-RAEB、AML阶段中,甲基化位点阳性频率存在明显差异(P=0.000),在AML阶段阳性频率最高(64.65%)。结论:ZO-1基因启动子区高甲基化发生于MDS/AML患者中,随着恶性克隆增生,ZO-1基因甲基化阳性率及甲基化位点阳性频率越来越高,在一定程度上预示着MDS疾病进展,进一步提示ZO-1基因甲基化水平可成为监测MDS患者急性白血病转化的新指标。

ZO-1基因甲基化状态在非霍奇金淋巴瘤骨髓检测中的临床意义

目的探讨紧密连接蛋白-1(ZO-1)基因启动子区甲基化状态在非霍奇金淋巴瘤(NHL)检测中的临床意义。方法采用甲基化特异性PCR方法(MS-PCR)分析10例非血液系统肿瘤者骨髓及45例NHL患者骨髓标本的ZO-1基因启动子区甲基化状况。结果ZO-1基因在10例良性血液病及正常人中呈完全非甲基化状态,在39例初治、复发、未完全缓解的淋巴瘤患者中甲基化阳性率53.85%(P<0.05)。在39例初治或复发或未达到完全缓解的NHL患者中28例Ⅲ、Ⅳ期的NHL患者ZO-1基因甲基化阳性率64.29%,11例Ⅰ、Ⅱ期的NHL患者ZO-1基因甲基化阳性率27.27%(P<0.05)。初治、复发患者28例中甲基化阳性16例(57.14%),经治疗达到部分缓解的11例患者中甲基化阳性5例(45.45%),临床缓解的6例患者均为完全非甲基化。结论ZO-1基因启动子区高甲基化与疾病分期及缓解明显相关,它可以作为判断NHL进展和评价预后的辅助指标,并以此指导临床治疗。

慢性粒细胞白血病ZO-1基因启动子区甲基化状态分析及临床意义探讨

目的通过对慢性期及急变期慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓标本中人紧密连接蛋白1(ZO-1)基因启动子区甲基化状态的分析,初步探讨其在CML病情发展变化中的临床意义。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测5例CML慢性期和10例CML急变期患者骨髓标本中ZO-1基因启动子区的甲基化状态。结果在5例CML-CP患者中ZO-1基因启动子区呈非甲基化状态;在7例CML-BP患者中ZO-1基因启动子区呈高甲基化状态,甲基化阳性率为70%(7/10);1例CML患者其慢性期骨髓标本ZO-1基因启动子区呈非甲基化状态,而急变期则呈甲基化状态,经治疗恢复到慢性期时,则又表现为非甲基化状态。结论 ZO-1基因启动子区甲基化状态可能与CML病情发展变化密切相关,可能是一个提示CML急变的分子标志物。

儿童急性白血病ZO-1基因甲基化状态临床意义分析

目的探讨紧密连接蛋白(zonula occluden protein-1,ZO-1)基因启动子区甲基化状态在儿童急性白血病(AL)骨髓检测中的临床意义。方法将48例确诊为AL(35例急性淋巴细胞白血病,13例急性髓细胞白血病)患儿的骨髓标本作为研究组,20例非血液肿瘤患儿骨髓标本作为对照组。采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测研究组与对照组ZO-1基因启动子区甲基化状态。逆转录PCR(RT-PCR)检测研究组与对照组ZO-1基因mRNA的表达情况。结果 MS-PCR检测结果显示,治疗前研究组ZO-1基因甲基化阳性率为68.8%(33/48),对照组均呈非甲基化状态(P<0.05);动态观察31例急性淋巴细胞白血病ZO-1基因甲基化阳性率:治疗前64.5%(20/31),治疗第33天48.4%(15/31),治疗第12周29.0%(9/31)。治疗过程中复发2例,甲基化状态由部分甲基化条带转变为完全甲基化条带。5例疗程结束,停药前仍有1例可检出。治疗前与治疗第33天、治疗第12周比较差异均有统计学意义(P<0.05),治疗第33天与治疗第12周比较差异有统计学意义(P<0.05);急性淋巴细胞白血病68.6%(24/35),与急性髓细胞白血病69.2%(9/13)比较差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR检测结果显示,研究组治疗前及动态观察中,ZO-1基因甲基化阳性病例均无mRNA表达,对照组全部表达。结论 ZO-1基因启动子区高甲基化状态在儿童急性白血病中有较高的特异性,与疾病发生、发展及转归密切相关。ZO-1基因有可能作为新的白血病分子标志,为临床早期诊断、疗效判断、预后评价、微小残留检测提供新的指标。

zo-1基因甲基化状态分析在骨髓增生异常综合征鉴别诊断中的意义

为探讨zo-1基因甲基化状态改变在骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndrome MDS)与血液系统非恶性疾病鉴别诊断中的意义,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR,MS-PCR)及逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测MDS细胞系MUTZ1、1例再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)患者及正常供者的骨髓(normal bone marrow,NBM)。通过甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specificPCR,MS-PCR),对37例MDS-RA患者、20例疑诊MDS患者及55例血液系统非恶性疾病患者骨髓标本进行检测。结果显示:①zo-1基因在MDS细胞系MUTZ1中呈完全甲基化且不表达,在1例AA患者骨髓及NBM中呈完全非甲基化且有表达;②zo-1基因在55例血液系统非恶性疾病患者骨髓标本中呈完全非甲基化状态,在MDS-RA患者骨髓中甲基化阳性率48.6%(18/37),二者差异有统计学意义(p<0.05);③20例疑似MDS患者中zo-1基因甲基化阳性率为35%(7/20)。随访甲基化阳性患者中的2例,均在1年内诊断为MDS。结论:MDS患者骨髓zo-1基因启动子区发生了高甲基化状态的改变,而血液系统良性疾病患者骨髓呈非甲基化状态。zo-1基因启动子区高甲基化在MDS患者骨髓标本中较特异,推测zo-1基因异常甲基化状态可能成为基因标志,它有助于MDS与AA等血液系统良性疾病的鉴别诊断,可应用于临床。

白血病相关基因zo-1参与白血病发病过程及其机制的初步研究

本研究探讨新的白血病相关基因zo-1在白血病细胞中的作用及其初步机制。应用甲基化PCR方法验证THP-1等白血病细胞中基因zo-1甲基化与白血病的关系,用甲基化PCR及RT-PCR方法验证THP-1等白血病细胞系中基因zo-1甲基化与基因表达的关系。选择基因zo-1高表达的THP-1细胞,用脂质体Oligofectamine将针对基因zo-1的小干扰RNA转染THP-1细胞,RT-PCR方法验证抑制效率,AnnexinV和PI观察细胞凋亡率,PI检测细胞周期,CCK-8检测细胞增殖。结果表明:急性白血病人中基因zo-1呈高甲基化状态,健康人群中基因zo-1不发生甲基化。基因zo-1未甲基化的THP-1细胞系高表达基因zo-1;基因zo-1高甲基化的Molt4及HL-60细胞系中不表达基因zo-1。脂质体Oligofectamine转染针对zo-1的小干扰RNA成功地抑制了THP-1细胞基因zo-1的表达,而不影响THP-1细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡。结论:基因zo-1为白血病相关基因,急性白血病中基因zo-1高甲基化,基因zo-1的甲基化状态调控基因zo-1表达。THP-1细胞中基因zo-1表达缺失不影响细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡。

急性白血病zo-1基因启动子区甲基化状态研究

本研究探讨健康人和急性白血病(AL)不同时期患者zo-1基因启动子区甲基化状态差异。采用硫化测序特异性PCR(BS-PCR)方法对白血病细胞系、AL患者及健康人骨髓标本进行zo-1基因启动子区甲基化状况检测。结果显示:在健康人骨髓中呈低甲基化状态(1.9%),初治、复发和完全缓解的AL患者骨髓中zo-1基因呈高甲基化状态,甲基化率分别为93.2%、66.9%及16.4%,明显高于健康人,差异均有统计学意义(p<0.05)。结论:与健康人相比,急性白血病患者骨髓细胞zo-1基因呈高甲基化状态,且AL不同时期的患者中zo-1基因都发生了不同程度的甲基化改变,对zo-1基因甲基化状态的分析有助于监测AL患者疾病的进展。

急性白血病ZO-1基因启动子区甲基化状态分析及其临床意义

目的探讨紧密连接蛋白-1（Zonula oecludem-1，ZO-1）基因启动子区甲基化状态在人急性白血病（AL）发生、发展中的作用及作为通用性基因标志物的临床意义。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）检测白血病细胞系HL60、Molt4、NK92和40例非恶性血液病以及81例AL骨髓ZO-1基因启动子区的甲基化状态。结果ZO-1基因启动子区在白血病细胞系中呈完全甲基化状态；而在40例非恶性血液病标本中均为非甲基化；81例AL标本中甲基化阳性率为60．49％（49／81），其中难治复发组为92．86％（13／14），高于初诊未治疗组65．85％（27／41）及完全缓解组34．62％（9／26）；急性髓细胞白血病组61．54％（32／52）与急性淋巴细胞白血病组58．62％（17／29）比较差异无统计学意义。结论首次证明ZO-1基因启动子区高甲基化状态在人AL中具有较高的特异性，与疾病发生、发展密切相关，可作为一个新的白血病通用分子标志。

ZO-1基因与白血病相关性的研究及其在K562细胞中高表达意义的探讨

目的探讨白血病细胞ZO-1基因的表达、甲基化情况及其与白血病发生的相关性。方法应用基因组限制性酶切扫描（RLGS）技术自白血病小鼠标本中钓取ZO-1基因，用甲基化PCR方法检测白血病细胞系Molt4、HL-60、K562细胞及白血病患者原代白血病细胞及正常人外周血单个核细胞ZO-1基因甲基化水平，用RT—PCR方法检测ZO-1基因表达水平，并对高表达ZO-1基因的K562细胞进行小干扰RNA（siRNA）靶向干扰，然后用Northern blot方法验证ZO-1基因抑制效率，用CCK-8检测细胞增殖情况，膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙锭（PI）双染色法观察细胞凋亡率及细胞周期。结果采用RLGS技术从白血病小鼠标本中成功钓取ZO-1基因。原代白血病细胞及Molt4、HL-60细胞ZO-1基因呈高甲基化状态，ZO-1基因表达水平较正常人外周血细胞明显下降或不表达。正常人外周血单个核细胞ZO-1基因不发生甲基化，ZO-1基因高表达。K562细胞高表达ZO-1基因，未见ZO-1基因甲基化；去甲基化药物可以诱导Molt4及HL-60细胞重新表达ZO-1基因。经ZO-1小干扰RNA干预的K562细胞ZO-1基因的表达明显降低，但并不影响细胞的增殖及凋亡。结论绝大多数急性白血病细胞中ZO-1基因呈高甲基化状态，表达明显降低，ZO-1基因是一个白血病相关基因。其在K562细胞中高表达的意义尚不明确。

儿童非霍奇金淋巴瘤ZO-1基因甲基化状态分析及临床意义

目的探讨紧密连接蛋白(ZO-1)基因启动子区甲基化状态在儿童非霍奇金淋巴瘤(NHL)Ⅳ期检测中的临床意义,以进一步寻找病因及早期诊断方法。方法将55例确诊为NHLⅣ期(T细胞型40例,B细胞型15例)患儿的骨髓标本作为病例组,20例非血液肿瘤患儿骨髓标本作为对照组。采用甲基化特异性PCR法(MS-PCR)检测病例组与对照组骨髓中ZO-1基因启动子区甲基化状态,并检测光密度积分值(IOD)。逆转录PCR法(RT-PCR)检测病例组与对照组ZO-1基因mRNA的表达情况。结果 MS-PCR检测结果显示病例组治疗前39例出现ZO-1基因甲基化条带,阳性率为70.9%(39/55),对照组20例均呈非甲基化状态;治疗过程中,行动态观察NHL患儿47例,其中T细胞型32例,B细胞型15例,治疗前ZO-1基因甲基化阳性率分别为72%和67%,两者差异无统计学意义(P>0.05)。T细胞型与B细胞型NHL患儿治疗前与化疗早期、中期比较差异均无统计学意义(P>0.05),而与化疗后期比较差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示病例组中ZO-1甲基化阳性病例均无mRNA表达,对照组患儿均表达ZO-1 mRNA。外周血白细胞总数与ZO-1基因IOD值无直线相关关系(r=0.093,P=0.575);骨髓中恶性肿瘤细胞数与ZO-1基因IOD值呈正相关关系(r=0.669,P<0.001)。结论 ZO-1基因在儿童NHL中呈特异性高甲基化状态,其程度与骨髓中恶性肿瘤细胞数呈正相关。ZO-1基因可能成为新的分子标志,为临床早期诊断、疗效判断、预后评价、微小残留检测提供新的指标。

试验条件下厚朴对鸡柔嫩艾美耳球虫病的防治作用

为了评价厚朴及厚朴与益生菌联用对鸡柔嫩艾美耳球虫病的防治作用,试验将90只1日龄广西三黄鸡随机分为6组,即阴性对照组、阳性对照组、地克珠利组(地克珠利,0.2 mL/L饮水)、厚朴组(4%厚朴粉末拌料)、厚朴+益生菌组(4%厚朴粉末+0.2%益生菌拌料)和益生菌组(0.2%益生菌拌料),在雏鸡25日龄时将厚朴粉和益生菌按不同的比例加入饲料中,饲喂至35日龄。雏鸡于28日龄时,除阴性对照组外均人工感染柔嫩艾美耳球虫。试验结束后称量各组雏鸡体重,统计盲肠病变记分、每克粪便中卵囊数(OPG)和抗球虫指数(ACI),之后进行盲肠组织病理学观察,测定肠道ZO-1、Occludin基因的相对表达量。结果表明:在球虫感染情况下厚朴+益生菌组末重高于阳性对照组;厚朴组和厚朴+益生菌组盲肠病变记分显著低于阳性对照组(P<0.05),同时可以降低感染雏鸡OPG;厚朴组ACI为140.35,厚朴+益生菌组ACI为144.44,均达到中等抗球虫水平。厚朴组和厚朴+益生菌组ZO-1、Occludin基因的相对表达量均高于阳性对照组,但差异不显著(P>0.05)。说明日粮中单独添加厚朴干燥粉或联合益生菌使用均可缓解感染球虫鸡的病变情况,对防治鸡球虫病具有一定效果。

ZO-1基因的慢病毒载体构建

目的:相邻两心肌纤维的连接处称心肌闰盘,它在心肌的机电活动中扮演重要角色。目前有关闰盘相关基因Cx43的研究已被广泛关注,而在不同心肌病理状态下,其变化及功能都与另一闰盘相关基因ZO-1有极为密切的联系。目前有关ZO-1的研究比较少,此次欲将猪ZO-1基因克隆到慢病毒表达载体并进行鉴定,为进一步研究其功能奠定基础。方法:利用聚合酶链反应(PCR)扩增猪ZO-1基因,并克隆到慢病毒表达载体,通过转化、抽提质粒、双酶切和测序鉴定构建的Lenti-EF1α-EGFP-TRE-ZO-1重组载体。结果:猪ZO-1基因片段重组到慢病毒载体;PCR和双酶切鉴定,电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段;经测序证实成功构建Lenti-EF1α-EGFP-TRE-ZO-1慢病毒表达载体。结论:通过一系列实验证实Lenti-EF1α-EGFP-TRE-ZO-1慢病毒表达载体构建成功,可利用其感染相关细胞或注入动物体内,为后续的体外及在体研究奠定基础,明确其在不同心肌病理状态下所发挥的独特作用。

艾灸对克罗恩病大鼠结肠肿瘤坏死因子-α含量及艾灸鼠结肠上清液对培养的结肠上皮细胞内紧密连接蛋白及其基因表达的影响

目的:通过观察温和灸、隔药灸对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)体外诱导大鼠结肠上皮细胞紧密连接——咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白1(claudin-1)和闭锁蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)及其基因表达的影响,探讨艾灸对肠上皮屏障损伤的修复/保护机制。方法:将SD大鼠随机分成正常组、模型组、温和灸组、隔药灸组和西药组,各12只。采用三硝基苯磺酸制备克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)大鼠模型。温和灸组与隔药灸组选择"天枢""气海"穴分别予以温和灸和隔药灸,每日1次,共治疗14次;西药组以柳氮磺胺吡啶溶液灌胃,每日2次,共14次。治疗结束后剖取各CD组大鼠结肠,制备结肠黏膜上清液;正常组纯化并培养结肠上皮细胞建立肠上皮屏障体外模型。将各CD组结肠黏膜上清液分别与正常大鼠结肠上皮细胞混合培养1周,采用ELISA法检测各组结肠黏膜上清液TNF-α含量,Western blot和荧光定量PCR法观察其对CD大鼠体外结肠上皮紧密连接occludin、claudin-1和ZO-1及其mRNA表达的影响。结果:CD模型组较正常组大鼠结肠黏膜上清液中TNF-α含量有显著增高(P<0.01),温和灸、隔药灸和柳氮磺胺吡啶治疗后TNF-α含量显著降低(均P<0.01),其中温和灸、隔药灸组优于西药组(均P<0.05);与此同时,温和灸、隔药灸和西药组结肠黏膜TNF-α上清液体外诱导大鼠结肠上皮紧密连接occludin、claudin-1和ZO-1及其mRNA表达较模型组有显著增高(P<0.01,P<0.05),且隔药灸、温和灸两组也优于西药组(均P<0.05)。结论:艾灸(隔药灸、温和灸)可能是通过降低CD大鼠结肠黏膜异常增高的TNF-α,进而促进或调节结肠上皮紧密连接occludinc、laudin-1和ZO-1及其mRNA表达,达到修复/保护肠上皮屏障损伤的目的。

ZONAB表达量与膀胱癌恶性程度的相关性研究

目的探讨膀胱癌组织中ZO-1相关性核酸结合蛋白(ZONAB)的表达量与膀胱癌恶性程度的相关性。方法纳入2015年6月至2017年10月在我院泌尿外科接受手术治疗的原发性膀胱癌患者78例,术中留取膀胱癌组织、癌旁正常组织各78份分别作为膀胱癌组织组、癌旁组织组。采用实时荧光定量PCR法检测标本中目标基因表达量,对比两组中ZONAB基因及增殖、凋亡、侵袭基因信使RNA(mRNA)表达量的差异,Pearson检验分析膀胱癌组织中ZONAB m RNA表达量与上述增殖、凋亡、侵袭基因mRNA表达量的关系。结果膀胱癌组织组ZONAB mRNA的表达量高于癌旁组织组(P <0.05);增殖基因(KPNA2、YAP、HSG)、凋亡抑制基因(Bcl-2、Livin、Survivin)和侵袭基因(SNCG、TRPM 8、PARP-1)mRNA的表达量高于癌旁组织组,凋亡基因(Caspase-3、Caspase-7)mRNA的表达量低于癌旁组织组(P <0.05)。Pearson检验发现,膀胱癌组织中ZONAB mRNA表达量与增殖基因(KPNA2、YAP、HSG)、凋亡抑制基因(Bcl-2、Livin、Survivin)、侵袭基因(SNCG、TRPM 8、PARP-1)mRNA的表达量呈正相关,与凋亡基因(Caspase-3、Caspase-7)mRNA的表达量呈负相关(P <0.05)。结论膀胱组织中ZONAB表达量增高,其与癌细胞的增殖、凋亡、侵袭活性相关,可作为膀胱癌辅助诊断及恶性程度判断的可靠指标。