西瓜PRSV-W和ZYMV-CH抗性的遗传与连锁分析

番木瓜环斑病毒西瓜株系(PRSV-W)和小西葫芦黄化花叶病毒中国株系(ZYMV-CH)是危害我国西瓜的主要病害。以抗病毒病西瓜野生种质P.I.595203与感病普通西瓜自交系98R为亲本,采用单粒遗传方式得到109个F3代株系。分别对亲本、F1及F3代109个株系群体进行了苗期抗PRSV-W和ZYMV-CH接种鉴定,通过F3代群体的抗感分离情况来推测F2代单株的基因型,并分别对PRSV-W与ZYMV-CH抗性遗传及其这2个抗性基因的连锁关系进行分析。研究结果发现P.I.595203对PRSV-W的抗性是由单隐性基因控制,同时可能存在微效修饰基因,将此基因暂定名为prs-W;同时进一步证实了西瓜对ZYMV-CH的抗性由单隐性基因zym-CH控制,zym-CH和prs-W2个抗性基因在遗传上存在一定连锁关系,其遗传距离是27cM。

ZYMV感染对甜瓜苯丙氨酸解氨酶和叶绿素的影响

研究了小西葫芦黄化花叶病毒新疆株 (ZYMV XJ)感染抗性不同的甜瓜品种后 ,苯丙氨酸解氨酶酶活性a(TAL)和叶绿素质量浓度 ρ(叶绿素 )的变化 ,与健康对照相比 ,受感染植株的a(TAL)均有所增高 ,但抗性品种“新玉”增高的幅度是感性品种“网纹香”的 2倍 ,a(TAL)峰早出现12d ,即抗性品种a(TAL)增高幅度大 ,峰出现早 .叶绿素的变化则与抗性呈负相关 ,抗性品种“新玉”受ZYMV XJ感染后的 ρ(叶绿素 )与健康对照差异不大 ,而感性品种“网纹香”的 ρ(叶绿素 )则比健康对照的下降了 6 2 .9% .a(TAL)和 ρ(叶绿素 )的变化均与甜瓜品种对ZYMV XJ的抗性呈现规律性的相关性 ,这种规律性可用于甜瓜品种对ZYMV XJ抗性鉴定的生化分析 .

黄瓜ZYMV-CH抗性遗传与连锁分子标记研究

小西葫芦黄化花叶病毒中国株系(ZYMV-CH)是危害我国黄瓜的主要病毒之一。本试验以抗病的‘秋棚’和感病的‘欧洲8号’杂交获得的115份重组自交系(RIL)为材料,进行了黄瓜抗ZYMV-CH遗传规律和连锁分子研究。结果表明:病情指数在黄瓜RIL群体呈双峰分布,表明其对ZYMV的抗性是受主基因控制的性状,但也存在微效基因的修饰作用。采用集团分离分析法(BSA)和AFLP技术,获得与ZYMV-CH抗性基因连锁的两条特异性片段(E-ACG/M-CAG-182和E-ACG/M-CAG-180),遗传连锁距离分别为5cM和11cM。将E-ACG/M-CAG-180特异片段转化成共显性的SCAR标记SCAR3-109,与ZYMV-CH的抗性基因遗传连锁距离为11cM。该标记可以作为黄瓜抗ZYMV辅助选择的分子标记。

小西葫芦黄花叶病毒dsRNA的原核表达及其对ZYMV的防治效果

【目的】小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害西瓜最为普遍的病毒,在西瓜上利用外源喷施病毒基因dsRNA的方法实现对ZYMV的预防和治疗。【方法】首先以实验室已有的ZYMV病毒序列为依据,针对其不同的基因片段,利用NCBI数据库找出与其相似的序列。随后利用软件DNAMAN8对序列进行多重比对分析,找出其保守区域,根据分析结果选择长度介于200-350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段,同时选择长度为190 bp的GUS基因片段作为对照。PCR扩增得到这6个片段后,利用同源重组的方法将它们插入到含有双T7启动子的L4440载体中,并利用RNAⅢ酶缺陷型大肠杆菌HT115建立原核表达系统生产dsRNA,采用超声波破碎的方法释放dsRNA,利用TE(10 mmol·L-1 Tris-HCl和1 mmol·L-1 EDTA)缓冲液溶解dsRNA,最后比较和分析IPTG使用浓度、诱导时间以及超声波破碎时间对dsRNA表达和释放的影响。在西瓜植株上采用喷施的方法施用dsRNA,设计先喷施dsRNA后接种病毒的预防试验和先接种病毒后喷施dsRNA的治疗试验,通过统计分析接种病毒后21 d发病率的方法评价dsRNA预防和治疗ZYMV的效果。【结果】针对ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段以及GUS基因片段建立了能够高效稳定表达和释放dsRNA的生产体系。在IPTG诱导浓度为8 mmol·L-1,诱导时间为7 h,在宁波新芝牌超声波细胞破碎仪3?的档位和60%的输出功率条件下破碎15 min,细胞可以有效产生和释放dsRNA。在对ZYMV的预防试验中发现,喷施GUS基因片段的dsRNA以及TE缓冲液的西瓜植株发病率均为100%的情况下,对ZYMV防治效果最好的是HC-Pro基因片段,接种ZYMV 21 d后防治效果可达到95%,防治效果相对较差的是NIb基因片段,但也可达到80%。在此基础上对HC-Pro片段预防和治疗ZYMV的效果进行了深入分析,结果发现在喷施HC-Pro片段的dsRNA后第3、5、7天接种ZYMV,植株发病率分别为16%、63%、63%,在接种ZYMV后第1、3、5、7天分别喷施HC-Pro片段的dsRNA,无明显的治疗效果,仅起到延迟植株发病的效果。【结论】建立了针对ZYMV不同基因片段的dsRNA原核表达体系,并发现基于HC-Pro基因片段产生的dsRNA对ZYMV防治效果最好,可显著降低植株的发病率、延迟植株发病时间,具有应用潜力。

黄瓜ZYMV抗性鉴定与抗性基因的分子标记辅助选择

近年来,小西葫芦黄化花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)在黄瓜(Cucumis sativus L.)上危害愈发严重,影响黄瓜植株的生长发育,降低黄瓜的产量与品质。由于ZYMV缺乏有效的防治药剂,因此需要培育ZYMV抗性黄瓜品种。以ZYMV Z5-1为病毒源,对不同黄瓜材料的ZYMV抗性进行鉴定,并对抗性位点候选基因进行了测序分析。结果显示,黄瓜品种SA02、SA06、S94、S1003、WI7230与TMG-1具有ZYMV抗性,其抗性候选基因Csa6G152960.1的突变位点一致。在ZYMV抗性鉴定的基础上,通过回交转育,将黄瓜自交系TMG-1中的ZYMV抗性基因转入感病自交系SA0422中,回交期间利用分子标记对回交群体进行前景选择和背景选择,经过3代回交,将ZYMV抗性基因转入SA0422,为培育抗ZYMV黄瓜新品种奠定了基础。

小西葫芦花叶病毒(ZYMV)抗血清制备及检测技术研究

从小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)免疫的母鸡蛋卵黄和兔抗血清中分别提取免疫球蛋白IgY和IgG,用多种血清学方法进行检测。结果表明,免疫鸡和兔25d后,鸡蛋卵黄IgY和兔抗血清的效价分别达到1/64和1/512。在琼脂扩散试验中,当抗体稀释28倍时,与抗原反应无明显沉淀线。在胶乳凝集试验中,抗体稀释210倍时,与抗原反应无明显凝集物。ELISA法以辣根过氧化酶标记抗体IgY和IgG,用双抗夹心法成功地检测出了ZYMV,当抗体稀释106倍时,与抗原反应仍呈阳性。免疫电镜方法检测ZYMV,较一般血清学方法可多捕捉50倍的病毒颗粒。

西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因的连锁分子标记研究

小西葫芦黄花叶病毒中国株系(Zucchini yellow mosaic virus Chinese strain,ZYMV-CH)是危害我国四瓜的主要病毒。本实验以抗病毒病西瓜野生种质P．I．595203与感病的普通西瓜自交系98R为亲本,采用单粒传方式得到109个E3代株系,分别对亲本、F1及109个F3代株系群体进行了苗期抗ZYMV-CH接种鉴定,通过F3代群体的抗感分离情况,推测得到 F2代各单株的基因型,采用集团分离分析法(bulked segregant analysis,BSA)在F2代建立抗感基因池,以亲本、F1和抗感基因池为模板,对640条RAPD引物进行PCR扩增筛选,其中引物AK13在亲本、F1和抗感基因池之间扩增出一条多态性片段(644 bp),在F2代群体上验证该多态性条带与ZYMV-CH的抗性基因呈现连锁关系,遗传连锁距离为8 cM,定名为 AK13-644,该连锁标记在ZYMV-CH抗性转育后代自交系上得到了验证。最终将此RAPD标记成功转化成SCAR标记 SCAK13-644,该标记可以作为西瓜抗病毒病辅助选择的分子标记。

小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

以小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)的中国分离物(CH-87)接种发病的叶片中提取的总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得ZYMV CP基因,将其克隆到pUCm-T质粒上进行序列分析。结果表明该CP基因由837个核苷酸组成,编码279个氨基酸。与已发表序列相比较,该CP基因与国际上已报道的4个基因型不同,应属于新的基因型,暂命名为基因型Ⅴ。

地高辛标记探针检测5种葫芦科作物病毒的斑点杂交方法

【目的】探索5种葫芦科作物病毒即小西葫芦黄花叶病毒(Zuccini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot viruswatermelon strain,PRSV-W)和南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)的斑点杂交检测技术,为葫芦科作物种子带毒的快速准确鉴定、流行病学研究和转基因检测等提供技术和方法。【方法】以构建的重组质粒为模板,用PCR方法合成了相应的地高辛标记的cDNA探针。通过斑点杂交检测西葫芦病叶汁液来考察探针的灵敏性和特异性。同时设计了3种不同长度的SqMV探针(0.55、1.6、2.7kb)对杂交效果进行了研究。【结果】ZYMV、WMV、CMV、PRSV-W和SqMV的5种探针检测各自侵染西葫芦病汁液的稀释低限分别为1﹕160、1﹕160、1﹕320、1﹕160、1﹕320,而每种探针与健康西葫芦和其它4种病毒的反应均为阴性。不同长度的SqMV探针杂交结果相同。【结论】用PCR方法合成的地高辛标记的探针,能够直接在植物组织中将5种病毒检测出来,具有较好的灵敏性、特异性和重复性。探针的长度对杂交的灵敏性和特异性没有影响。

两种葫芦科病毒的分子检测和致病性研究

小西葫芦黄化花叶病毒 (ZYMV)和黄瓜花叶病毒 (CMV)是浙江及其周边地区侵染葫芦科植物最主要的病毒种类。本文通过RT PCR和基因克隆 ,获得了侵染南瓜的CMV杭州分离物 (HZ0 1S10 )的 3' 端序列 ,通过CP氨基酸序列同源性分析 ,确定其属于CMV亚组I;分别以3 2 P标记的ZYMV和CMV基因组cDNA作为探针 ,用RNA点杂交方法定点检测了浙江地区自然感病的葫芦科作物中以上 2种病毒的发生情况。ZYMV和CMV在葫芦科作物上的发生表现出显著的季节性差异 :夏季CMV发生普遍 ,只有部分南瓜和甜瓜感染ZYMV ;ZYMV则主要发生在秋季 ,同一时期未检测到CMV。此外 ,幼苗期接种试验显示 :以上 2种病毒对西葫芦 (早青一代 )、丝瓜 (中长 )、黄瓜 (津绿 4号 )的致病性存在明显差异 ,供试西葫芦对ZYMV比较敏感 ,供试丝瓜对CMV更敏感 ,而供试黄瓜品种对以上 2种病毒均表现抗病。

黄瓜抗病毒病材料的鉴定与筛选

病毒病是为害作物的主要病害,几乎所有作物都可发生病毒病.侵染瓜类作物的病毒种类较多,目前报道的从瓜类作物上分离和鉴定的病毒有28种[1],侵染黄瓜的主要有7种:CMV(黄瓜花叶病毒)、WMV(西瓜花叶病毒,原WMV-2)、ZYMV(西葫芦黄化花叶病毒)、ZYFV(西葫芦黄斑病毒)、PRSV-W(番木瓜环斑病毒西瓜株系,原WMV-1)、MWMV(摩洛哥西瓜花叶病毒)、CGMV(黄瓜绿斑花叶病毒)[1,2].

黄瓜新品种中农16号的选育

中农16号是以早熟、优质、丰产自交系01316为母本,优质、抗病、耐热自交系99246为父本配制而成的一代杂种.早熟,从播种到始收52 d(天)左右,瓜条长棒形,长28～35 cm,粗3.5 cm,瓜色深绿,有光泽,单瓜质量200g左右,干物质含量4.42%,可溶性固形物含量4.0%,口感甜脆.高抗ZYMV、WMV、角斑病,抗白粉病,中抗霜霉病、枯萎病、CMV.适于春秋大棚及春露地栽培.

西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒种质资源鉴定

通过对西瓜抗ZYMV病毒病资源的抗性鉴定,为资源创新利用及抗性育种提供基础材料。以西瓜甜瓜中期库内保存的754份西瓜种质资源为材料,通过苗期摩擦子叶法接种病毒鉴定西瓜对ZYMV的抗性,结果表明:4份材料对ZYMV免疫,1份抗病。其中2份免疫材料‘PI494530’、‘PI595203’和1份抗性材料‘PI299536’来自美国,另外2份免疫材料‘2013K12’和‘2013K15’来自我国西瓜甜瓜中期库。

复合侵染瓠瓜的两种病毒的互作研究

小西葫芦黄化花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)是侵染葫芦科植物的主要病毒。本研究在三种供试品种的瓠瓜上单独和混合接种ZYMV和CMV,对各处理的病情和病毒积累量进行分析。两种病毒在三种瓠瓜供试品种上均表现明显的致病性。ZYMV和CMV的复合侵染加重瓠瓜发病症状,表现为协生作用。应用酶联免疫吸附法(ELISA)对三种瓠瓜上ZYMV与CMV进行检测并分析了病毒的积累量。结果表明,复合侵染情况下CMV的积累高于单独侵染,与致病性检测结果一致。

一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒

本文在两步RT- PCR检测ZYMV的基础上进行了一步法RT- PCR检测小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的实验,并对商品化一步法RT- PCR试剂盒和本文实验的一步法RT -PCR的效果和成本进行了比较,最终建立了一种比较实用的检测ZYMV的方法。

过氧化物酶与不同甜瓜品种对小西葫芦黄化花叶病毒抗性的关系

研究了对小西葫芦黄化花叶病毒新疆株（Zucchiniyellowmosaicvirus-Xinjiangstrain，ZYMV）抗性不同的甜瓜品种受病毒感染后过氧化物酶活力及其同工酶谱的变化．与健康对照相比，受感染植株的酶活力均有所增高，但不同抗性品种受感染植株酶活力增高的幅度、酶活力高峰出现的时间和同工酶谱带的增多，均表现与抗性相关的规律性差异．抗性品种“新玉”的酶活力增高幅度是感性品种“网纹香”的2倍，酶峰早出现12d；2条只在感染植株中出现的同工酶带C和E在“新玉”中较“网纹香”中早出现15d，并多维持12d．抗性居中的品种“红心脆”和“向里黄”的以上指标则居“新玉”和“网纹香”之间．2条健康对照和感性品种都不存在的酶带H和I，则仅在抗性较强的品种中出现．

新疆吐鲁番地区三种甜瓜病毒病的发生与分子鉴定

【目的】明确吐鲁番地区西瓜花叶病毒(WMV)、小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)、南瓜蚜传黄化病毒(CABYV)的发生情况及三种病毒不同来源分离物间的遗传差异。【方法】采用分子检测方法,确定吐鲁番地区甜瓜CABYV、WMV、ZYMV的侵染比例,应用序列比对及构建系统发育树分析三种病毒,吐鲁番分离物与国内外其他分离物间遗传差异。【结果】吐鲁番地区40份病毒病样中WMV、ZYMV、CABYV分子检测阳性比例分别达87.5%、50%、30%。ZYMV吐鲁番分离物等部分国内外分离物NIB与CP蛋白之间存在蛋白切割位点Q/S,WMV、ZYMV吐鲁番分离物等部分国内外分离物DAG基序的氨基酸序列均为DAG。依据系统发育树分析将三种病毒吐鲁番分离物分别划分至不同的亚组。【结论】WMV、ZYMV为吐鲁番地区甜瓜病毒病的优势毒原,CABYV为吐鲁番地区甜瓜病毒病的主要病毒之一。CABYV、WMV吐鲁番分离物与国内部分省份分离物亲缘关系更近,ZYMV吐鲁番分离物XJturufan2与东欧、中东国家的分离物亲缘关系更近,ZYMV吐鲁番分离物XJturufan与国内部分省份分离物及美国、西班牙、日本等国分离物亲缘关系更近。

南瓜病毒病的研究进展

综述了南瓜病毒病的主要毒原 ,黄瓜花叶病毒 (CMV)、西瓜花叶病毒 2号 (WMV- 2 )、番木瓜环斑病毒 (Pa RSV)、南瓜花叶病毒 (Sp MV)、小西葫芦黄化花叶病毒 (ZYMV)、中国南瓜曲叶病毒 (SLCV)的生物学特性、抗源。

小西葫芦黄花叶病毒在广西瓜类作物上的发生情况初报

用DAC -ELISA对广西各地瓜类作物病毒病样品 4 4 8份进行小西葫芦黄花叶病毒 (ZYMV)检测 ,结果表明 :该病毒在广西瓜类作物上普遍发生 ,ZYMV阳性检出率为 77.6 8% ,西瓜、甜瓜、南瓜、西葫芦、黄瓜、苦瓜、瓠瓜和蛇瓜样品的阳性检出率在 5 8.33%～ 10 0 %之间 ,冬瓜、丝瓜样品的阳性检出率分别为 2 0 %和 2 8.5 7%。ZYMV是侵染广西瓜类作物的主要病毒之一。

侵染南瓜的小西葫芦黄化花叶病毒的分离与鉴定

1999年秋在杭州一株表现典型黄化花叶的南瓜(Cucuribita moschata)上分离获得一株线状病毒HZ00s1.该病毒分离物在葫芦科作物(Cucuribitaceae)上引起系统症状.经寄主反应测定、病毒形态学和寄主组织病变观察,初步确定该病毒为小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV).对ZYMV杭州分离物(HZ00s1)的外壳蛋白序列及3’端非编码区进行了克隆及序列测定,并与ZYMV Conneticut分离物、Florida分离物、California分离物以及WMV2 Tonga分离物进行了同源性分析.结果显示:HZ00s1分离物与其它3种ZYMV分离物CP基因核酸序列同源性为93％～94％,而与WMV2 Tonga分离物的同源性仅为67％,来自美国的3种ZYMV分离物之间的同源性高达95％～99％.HZ00s1分离物与其它3个ZYMV分离物CP氨基酸序列同源性在95％～98％之间.因此确定在杭州地区葫芦科作物上有ZYMV的发生.