Zwint-1及其变异体Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期中的亚定位

目的:探讨Zw10结合因子-1(zeste white 10 interactor-1,Zwint-1)及其变异体(Zwint-1v)在HeLa细胞不同细胞周期中的亚定位。方法:采用胸腺嘧啶核苷双阻断法将HeLa细胞同步化,通过瞬时转染及间接免疫荧光检测,观察Zwint-1及Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期中的亚定位。结果:在HeLa细胞间期,Zwint-1野生型定位于细胞质,而Zwint-1v定位于细胞核;在分裂期,Zwint-1野生型及Zwint-1v定位于纺锤体与着丝粒上。Zwint-1v定化较野生型更趋近于细胞核。结论:Zwint-1及Zwint-1v在HeLa细胞不同细胞周期的亚定位存在差异。

HeLa细胞中Zwint-1选择剪接亚型v7的表达鉴定

目的:验证在HeLa细胞系中是否存在Zwint-1 v7选择性剪切亚型的mRNA和蛋白产物。方法:在缺失片段两侧设计引物,利用PCR和克隆测序验证HeLa细胞中是否存在缺失片段的mRNA;构建Zwint-1 v7 3′端特异区段(Z7)的GST融合表达载体pGEXKG-GST-Z7,转化入BL21菌种诱导表达,菌体经超声破碎和2 mol/L尿素洗涤纯化,融合蛋白经SDS-PAGE电泳并切胶回收后作为抗原与佐剂混合乳化并免疫C57BL/6小鼠,收获多克隆抗血清Anti-Z7,采用Dot b lot检测多克隆抗体的效价,Western blot检测HeLa细胞全蛋白中的Z7蛋白产物。结果:PCR和测序结果表明存在缺失37 bp的核酸片段;SDS-PAGE电泳显示在30.7 kDa处出现明显的蛋白条带;Dot blot结果表明1∶5 000稀释的多克隆抗体能检出12 ng GST-Z7;Western blot结果表明,1∶200稀释的多克隆抗体可识别HeLa细胞中Zwint-1 v7蛋白。结论:本研究在核酸水平和蛋白水平初步验证了HeLa细胞中存在Zwint-1 v7。