玉米AAP基因密码子偏性与进化分析

氨基酸透性酶(AAP)通过参与植物体内氨基酸吸收和转运,从而改变植物生长发育。研究其密码子偏好性,对AAP基因异源表达、功能验证及完善其遗传转化体系具有指导意义。使用Codon W、EMBOSS、Origin 2021以及SPSS等程序软件,对25个物种的AAP基因密码子进行聚类、中性、ENC以及PR2绘图分析,选择玉米AAP最佳异源表达受体及遗传转化受体。结果表明:玉米AAP基因的CAI、ENc、GC值分别为0.269、35.48、65.3%,表明其密码子偏好性较弱,且在编码蛋白过程中偏好以G/C结尾;RSCU聚类分析表明,玉米AAP基因与单子叶禾本科植物的使用偏好性相近,且同源关系也较近;而中性、ENC以及PR2绘图分析显示,玉米AAP基因密码子偏好性受自然选择影响较大;密码子使用频率分析表明,大肠杆菌比酵母表达系统更适合作为玉米AAP基因的异源表达受体,水稻更适合作为遗传转化受体。本研究为今后玉米AAP的功能验证及转基因植物培育等提供了研究基础。

茶树CsAAPs亚家族基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术,从龙井43中成功克隆了5个茶树AAPs(Amino acid permeases,氨基酸通透酶)基因。氨基酸序列比对结果表明,5个CsAAPs亚家族蛋白的序列同源性较高,为70.27%。根据氨基酸序列同源性构建系统发育树,结果显示5个CsAAPs分属3组。生物信息学分析表明,CsAAPs均含有9~10个跨膜区域和16~18个AAP保守基序。为了研究该亚家族对氮素的响应情况,选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,氮饥饿两周后,分别供应不同浓度的NH4NO3,然后利用qRT-PCR对CsAAPs在不同组织、氮素水平及茶树品种中的表达情况进行分析。研究发现CsAAPs在营养组织中均有表达,但是存在一定的组织表达差异,其中CsAAP3在茎中表达量最高,CsAAP8的主要表达部位为根和茎。在给氮素饥饿处理的茶苗从新供氮之后,CsAAP3的基因表达在3个氮素利用效率不同的品种间差异较大;在氮高效品种中茶302茎中表达的CsAAP3和CsAAP8,可以快速地对低氮条件做出响应,在低氮处理3 h后,基因表达水平明显增加。此研究预示着CsAAPs亚家族在茶树体内可能通过复杂的氨基酸转运参与氮代谢调控。

水稻氨基酸透性酶基因OsAAP14启动子克隆及时空表达特性分析

【目的】克隆水稻氨基酸透性酶基因OsAAP14的启动子序列并分析其时空表达特性,为解析氨基酸转运基因生物学功能及了解水稻对有机氮源的响应和氨基酸吸收利用提供理论依据。【方法】PCR扩增OsAAP14基因的启动子序列,并与p CAMBIA1391Z空载体质粒连接构建出启动子-GUS表达载体,并通过农杆菌介导侵染水稻中花11愈伤组织,获得OsAAP14基因的启动子-GUS转基因植株,通过对转基因植株不同组织部位进行GUS染色,并采用石蜡切片技术观察各组织细胞部位表达,经5种不同氨基酸处理后进行根部GUS染色,结合实时荧光定量PCR检测OsAAP14基因在GUS染色部位的相对表达量,最后综合分析该基因的时空表达特性。【结果】克隆获得OsAAP14基因启动子序列为1993 bp,与参考序列日本晴OsAAP14(LOC_Os04g56470)序列一致。该启动子序列含有MBS、P-box、ABRE、CGTCA-motif等激素或胁迫响应元件。从OsAAP14基因的启动子-GUS植株T0代中鉴定获得16个阳性转基因株系。T1代材料不同组织部位GUS染色及实时荧光定量PCR结果均显示,OsAAP14基因在水稻芽伸长的基部和叶片相对表达量较高,在根、叶鞘和穗也有一定表达,但在茎中的相对表达量最低。石蜡切片分析结果显示,OsAAP14基因在根部皮层薄壁细胞、叶片的叶肉细胞、穗的颖壳内部细胞有较高的表达。碱性氨基酸的组氨酸处理下根中的OsAAP14基因表达量随着处理时间的增加显著提高(P<0.05,下同),且赤霉素和脱落酸处理下,根中的OsAAP14基因相对表达量也显著提高。【结论】OsAAP14基因在水稻不同组织均有表达,正常情况(未处理)下在水稻基部和叶片中相对表达量较高,但外源氨基酸和激素处理时,在根中该基因被诱导表达上调,说明OsAAP14基因正常情况下可能主要参与调控水稻地上部分氨基酸的运输,但当外界氨基酸和激素含量增加时则参与调控水稻根部氨基酸的运输。

表皮葡萄球菌的生物膜形成及其相关基因的研究

[目的]研究表皮葡萄球菌的生物膜形成与其相关基因间的关系.[方法]用96孔聚乙烯板进行生物膜形成试验,以PCR法、RT-PCR法检测与生物膜形成相关的基因及其表达.[结果]aap是生物膜形成过程中的必须基因;bhp的编码表达与葡萄糖的存在有一定的关系;ica操纵子在合成PIA时不受葡萄糖添加的影响.[结论]ica操纵子、aap、bhp基因参与表皮葡萄球菌生物膜形成过程.

玉米氨基酸转运蛋白ZmAAP基因的克隆及序列分析

克隆得到玉米中AAP基因的核酸序列,通过对其编码蛋白理化性质、跨膜区、高级结构等方面进行生物信息学分析,为进一步深入研究玉米AAP基因的功能提供理论依据。采用同源克隆技术得到含有完整编码阅读框的一段玉米未知功能基因,使用ProtParam、ProtScale、TargetP v1.01 server、SignalP4.1 server、TMHMM services v.2.0、SOPMA、Phyre2、DNAman等软件对该基因进行生物信息学分析。结果表明:克隆的玉米未知功能基因全长cDNA序列为1396 bp,包括1212 bp的开放阅读框,编码的氨基酸数403个,分子质量42.88 kD,理论等电点9.24,正、负电荷残基总数分别是18和30,在组成蛋白编码的20种氨基酸中丝氨酸所占比例最高,为13.4%,而组氨酸比例最低,为1.0%。AAP蛋白包含信号肽,剪切位点位于38、39残基处;编码区核苷酸序列与其他作物对比后发现,与大麦AAP1基因的相似性最高,相似度为87%。通过生物信息学分析初步证明从玉米中克隆的基因为AAP的核酸序列,命名为ZmAAP。

表皮葡萄球菌生物膜形成及相关基因的检测及评价

目的了解临床分离表皮葡萄球菌形成生物膜的状况,分析参与细菌黏附或聚集的icaA、aapf、be和atlE基因与生物膜形成的相关性。方法收集成都地区两所医院临床分离的表皮葡萄球菌45株,采用半定量黏附实验和扫描电镜检测其生物膜形成,PCR检测icaA、aapf、be和atlE基因,采用列联表2χ检验分析这些基因与生物膜形成的相关性。结果45株表皮葡萄球菌中生物膜形成株18株,占40.00%;PCR检测icaA、aapf、be和atlE基因阳性率分别为28.89%、77.78%、93.33%、80.00%;其中icaA、aap基因与生物膜形成相关性差异有统计学意义(P<0.05),icaA+/aap+及icaA-/aap+的表皮葡萄球菌均能形成生物膜,而icaA-/aap-表皮葡萄球菌不能形成生物膜;fbe、atlE基因与生物膜形成相关性差异无统计学意义。结论icaA、aap基因参与了表皮葡萄球菌生物膜的形成过程;且aap基因可能是生物膜形成的必需基因。

金黄色葡萄球菌生物被膜基因型的分子鉴定

本文选用常见的典型食源性微生物金黄色葡萄球菌,从食品微生物安全角度出发,采用生物被膜菌落结晶紫染色法定量检测58株金黄色葡萄球菌菌株生物被膜的形成能力。并对金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因型进行分型研究,包括ica调控子分型(ica A、ica D、ica BC)与粘附特性分型(agr、atl E和aap)研究。结果显示,所有检测菌株均能生成生物被膜,其中3株能生成强粘附性生物被膜,占5.2%;生成中等生物被膜能力菌株有23株,占39.7%;32株金黄色葡萄球菌生成弱粘附生物被膜,占55.2%。实验所用的58株菌株中有48株能扩增出ica A基因,56株扩增出ica D基因,57株扩增出ica BC基因,56株扩增出agr,分别有53株和57株染色体中存在aap和atl E基因。本实验的结论:ica操纵子为金黄色葡萄球菌生物被膜形成所必须,aap基因可能作为促进金黄色葡萄球菌生物被膜形成的一个独立因素。而atl E,agr基因是金黄色葡萄球菌生物被膜粘附过程中形成所必须的调节因子。