乌珠穆沁绵羊ABCD4基因点突变与多脊椎性状关联性分析

为研究ABCD4基因在乌珠穆沁羊群体中基因的多态性与脊椎数的关联,从339只乌珠穆沁绵羊采集静脉血提取DNA,并且通过DR成像检测技术将乌珠穆沁绵羊的胸椎数和腰椎数进行了统计,PCR技术和Sanger测序技术等方法对ABCD 4基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点分别是SNP1(Chr7:89387652,C>T)和SNP2(Chr7:89393414,G>A)进行了研究。结果表明,SNP1与SNP2位点的突变结果基本一致,统计变异位点基因型以及等位基因型在乌珠穆沁绵羊群体的分布,并与脊椎数进行关联分析。在339只乌珠穆沁绵羊群体中,通过DR成像检测技术,确定出有普通脊椎羊55只,多脊椎羊为284只,通过Sanger测序技术,确定有普通脊椎羊50只,多脊椎羊为289只。SNP1(89387652,C>T)和SNP2(89393414,G>A)位点所检测出基因型与DR检测的吻合率为87.32%。说明关联显著的ABCD4基因的SNPs位点SNP1(Chr7:89387652,C>T)和SNP2(Chr7:89393414,G>A)可以作为乌珠穆沁绵羊脊椎数变异的候选基因功能位点。

巴马小型猪ABCD 4基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

【目的】获取巴马小型猪ATP结合盒D亚科成员4(ATP binding cassette subfamily D member 4,ABCD4)基因CDS区序列并预测其编码蛋白的结构功能,构建真核表达载体,了解ABCD 4基因在巴马小型猪中的组织分布情况,为探究ABCD 4基因对巴马小型猪生长发育的作用提供理论和分子基础。【方法】以巴马小型猪皮下脂肪组织cDNA为模板,利用RT-PCR对ABCD 4基因CDS区进行扩增、测序,利用生物信息学分析软件对巴马小型猪ABCD 4基因CDS区序列与不同物种比对,构建系统进化树,并对ABCD4蛋白的理化性质、跨膜结构等进行预测。将获得的目的基因连接至pEGFP-N1载体并转染到IPEC-J2细胞,检测转染后荧光和基因表达量变化。通过实时荧光定量PCR检测巴马小型猪各组织ABCD 4基因表达量。【结果】巴马小型猪ABCD 4基因CDS区全长1818 bp,编码605个氨基酸,与Ensembl上猪参考序列(ENSSSCT00000037529)的相似性为99.7%,存在6处碱基突变和1处碱基插入。相似性比对发现,猪和人、原鸡、倭黑猩猩、马、双峰驼、牛ABCD4序列的相似性分别为87.6%、72.7%、87.6%、91.7%、88.1%和88.6%。系统进化树显示,猪与马亲缘关系最近,与原鸡亲缘关系最远。生物信息学分析显示,ABCD4蛋白分子质量为68.66 ku,理论等电点(pI)为7.13,存在5个跨膜螺旋结构,无信号肽,属于跨膜蛋白;存在58个磷酸化位点和10个N-糖基化位点;二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链占比分别为50.91%、3.64%、28.43%和17.02%。细胞转染试验结果显示,转染30 h后重组质粒组和空载体对照组均有荧光出现,且转染重组质粒的细胞内ABCD 4基因表达量极显著高于空载体对照组(P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,ABCD 4基因在巴马小型猪皮下脂肪中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05);在心脏中表达量最低。【结论】本试验成功扩增获得巴马小型猪ABCD 4基因CDS区序列,ABCD4蛋白是一种疏水性跨膜蛋白,主要在巴马小型猪皮下脂肪中表达。本试验结果为探究ABCD 4基因对猪背膘厚的影响提供了分子依据。

长春碱增加班马鱼肿瘤耐药基因abcb4的表达

目的通过研究长春碱(VBL)对斑马鱼早期发育过程中abcb4肿瘤耐药基因表达的影响,为进一步建立抗肿瘤药物多药耐药筛选的斑马鱼模型奠定重要的实验基础。方法将长春碱稀释成不同浓度梯度的药液,在受精后0.5~1.5 h的斑马鱼胚胎上完成药物暴露实验,计算出长春碱IC_(50)的数值。设置长春碱为实验组,胚胎培养液为空白对照组,分别作用于受精后0.5~1.5 h的斑马鱼胚胎,观察受精后24~120 h的斑马鱼胚胎发育情况,记录死亡、孵化及畸形的胚胎数目;收集不同组别的斑马鱼胚胎,通过实时荧光定量PCR和胚胎整体原位杂交的方法,检测斑马鱼胚胎中abcb4基因的表达量。结果计算出长春碱在斑马鱼胚胎中的IC_(50)为3.08μmol/L;与对照组比较,实验组的斑马鱼胚胎abcb4基因的mRNA水平明显升高(P<0.05);通过胚胎整体原位杂交的方法,在受精后120 h斑马鱼胚胎的小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且实验组斑马鱼胚胎在脑和心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号。结论长春碱能明显增加斑马鱼早期胚胎中abcb4肿瘤耐药基因的表达水平,提示使用斑马鱼可以复制肿瘤耐药模型。