一种虫草无性型营养缺陷型的诱变筛选

古尼虫草小孢变种 (Cordycepsgunnii var.minor) 的无性型古尼拟青霉小孢变种 (Paecilomycesgunniivar.minor) G1 0 6菌株用两次紫外线处理法进行诱变 ,可使突变率增加 4倍。对其中两株生长较好的突变株进行鉴定 ,结果为蛋氨酸缺陷型和亮氨酸缺陷型。

乙酸渗漏型丙酮酸高产菌的选育

对Torulopsis glabrata WSH-IP303进行NTG诱变,挑选以乙酸为补充碳源的平板上透明圈较大的菌落,经初筛和复筛,发现T.glabrata WSH-LQ307生产丙酮酸能力强且稳定。以乙酸为补充碳源摇瓶培养48h,其丙酮酸产量(46.2g/L)比出发菌株(38.3g/L)提高了21％。采用该菌株在5L发酵罐上进行4批发酵实验,丙酮酸产量在64h最高可达68.7g/L,对葡萄糖的转化率为0.651g/g。

粪产碱菌的Tn5转座诱变及吲哚乙酸生物合成特性的研究

粪产碱菌 (Alcaligenesfaecalis)A1 50 1的吲哚乙酸 (IAA)合成需要外源色氨酸参与。在不含色氨酸的限制性培养基中 ,A1 50 1能良好生长 ,但不能合成IAA ,表明在A1 50 1中存在一条依赖于色氨酸的IAA合成途径。A1 50 1的IAA合成具有菌体密度依赖特性。采用Tn5转座诱变技术构建A1 50 1的突变库 ,从 350 0多株Tn5转染子中分离到一株色氨酸营养缺陷型突变株AT63。该Tn5突变株在不含色氨酸的限制性培养基上不能生长 ,但仍能进行IAA的生物合成 ,每毫升菌体密度等于 1 0的突变株菌体的IAA合成量为 2 2 4 μg。对突变株AT63的研究表明在A1 50 1中至少存在两条IAA合成途径 :一条以色氨酸为合成前体 ,另一条以吲哚 - 3-磷酸甘油为前体。southern杂交结果表明突变株中Tn5插入位点可能位于编码色氨酸合成酶基因上。

酱油工业生产菌沪酿3042基因工程转化体系的构建

以工业酿造常用菌株米曲霉沪酿3042为出发菌株,采用紫外诱变和氯酸钾压迫相结合的方法,得到硝酸盐营养缺陷型(niaD-)宿主菌,将含有niaD基因的载体转化到该宿主中,转化率为0.7个转化子/μgDNA,相对比较低,但转化子传代数次后遗传仍很稳定,该转化体系可用于工业生产菌沪酿3042的遗传改造。

费氏中华根瘤菌腺嘌呤缺陷突变株的构建与筛选

构建出费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶基因purL的基因置换载体pHN70 1 ,purL内部NotⅠ XhoⅠ片段被luxAB基因取代 ,造成正常基因的破坏。用该载体对野生型费氏中华根瘤菌HH1 0 3进行purL的基因置换 ,筛选到腺嘌呤缺陷型突变株P82 5。波动实验和连续转接试验结果表明该突变菌株表型十分稳定。purL表达载体pBBR PG在P82 5中可恢复其在基本培养基上的生长情况 ,证明突变株确实为purL单基因破坏。盆栽结瘤实验结果表明 。

哈茨木霉强根际定殖能力菌株的筛选

用紫外线诱变哈茨木霉野生型菌株,经含多菌灵PDA培养基耐药性筛选,获得了耐药性菌株。用根际土壤木霉种群密度比较法对筛选的耐药性菌株和野生菌株进行根际定殖能力的比较测定,结果表明筛选的哈茨木霉耐药性菌株提高了根际定殖能力。在基本培养基上生长测定表明,由多菌灵诱变的耐药性菌株为营养缺陷型的突变体,对根际分泌物具有亲和性,只有聚居在植物根上才能生长得好。

发酵法生产5’-肌苷酸的研究 Ⅰ.高产菌株的选育

报道了从自然界分离产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)进行遗传诱变,获得突变株直接发酵法生产5′—肌苷酸的研究结果.从采集的婴幼儿大便及鸟类粪便中,分离鉴定出6株产氨短杆菌.将其中的No.18和No.20用紫外线,硫酸二乙酯,亚硝基胍以多种不同方式进行诱变处理,用青霉素浓缩缺陷型.通过对2万多个单菌落的逐个检查,筛选鉴定出7株腺嘌呤缺陷型(A-),1株鸟嘌呤缺陷型(G-),12株腺嘌呤鸟嘌呤双重缺陷型(A-G-).摇瓶发酵结果,有3株A-G-产多量5′—肌苷酸,其中No.18—AG—17产量比较稳定,最高产量达12.1mg/mL。

香菇原生质体诱变及营养缺陷型突变体筛选

从香菇(Lentinus edodes)单核菌丝分离出的原生质体铺于含0.6mol/l蔗糖的CM表面,经紫外线照射30秒后,生长出的菌落被转移到MM之上。在MM上生长停止或生长缓慢的菌落经进一步检测,得到7个营养缺陷型突变体。经斜面CM上3次转代培养及原生质体分离和再生,表明有3个突变体仍保持稳定;可用作细胞融合研究,但其原生质体产量尚需进一步提高。

光木耳和琥珀木耳营养缺陷型菌株的辐射诱变及鉴定

生理盐水配制的木耳单核担孢子悬浮液，用剂量１００－２０００Ｇｙ、剂量率２０Ｇｙ／ｍｉｎ的钻６０ｖ射线辐照后，挑取３１００个辐照处理单孢萌发菌落在完全培养基和基础培养基上筛选，共获得９株稳定的营养缺陷型单核菌株。辐照诱变频率２．３８×１￣（－３）－４．４４×１０￣（－２）。营养缺陷型菌株原生质体回复突变率小于１０￣（－６）。营养缺陷类型包括氨基酸、维生素和核酸碱基的单缺类型和复合多缺类型。

自絮凝工业酒精酵母营养缺陷型的筛选和鉴定

运用紫外诱变方法成功获得了自絮凝酵母的营养缺陷型突变体,并且优化了诱变方法,证明了通过紫外诱变也可获得自絮凝酵母的营养缺陷型突变体。实验证明,较低的致死率更容易获得突变体,利用制霉菌素的富集可明显减少非缺陷型背景。本实验获得了组氨酸和尿嘧啶营养缺陷型各一株,其中组氨酸缺陷型菌株失去絮凝特性,而尿嘧啶缺陷型保持了良好的絮凝特性。继代实验表明,二株突变体均可以稳定遗传。并利用交配型PCR方法证明了絮凝酵母及其两株突变体与其酿酒酵母亲本类似,均为交配型杂合体。

桃红平菇原生质体诱变营养缺陷型突变体

从桃红平菇单核菌丝分离出原生质体铺于含0.6mol/l蔗糖的CM表面,经紫外线处理一定时间后,培养7—10天后长出的菌落被转于MM之上,在其上生长十分缓慢或停止的菌落通过各种营养添加物测其营养需求,最后得到一个需要补充丙氨酸和天冬氨酸才能正常生长的双缺突变体。试验表明,该突变体能很好地分离出原生质体,且在含0.6mol/l蔗糖的MM上不能再生,因而具有较好的应用前景。

双孢蘑菇的单孢分离和单孢杂交研究

本文采用一种较为简单易行、高效、选择性强的单孢分离法，分离获得双孢蘑菇的单孢菌林１５８株，并对这些单孢菌株的培养性状、菌丝间融合和自发营养缺陷型等进行研究。结果表明：来自同一子实体的许多单孢子在ＰＤＡ培养基上其菌丝体形态、生长速度均有显著差异：单孢菌株之间的融合率为１８．１％；单孢菌株中存在自发营养缺陷型，自然发生率为１０．１５％；活蘑菇菌丝体及高浓度孢子悬液对于单孢子萌发均具明显的促进作用。

利用制霉菌素浓缩处理高频率地检出黑曲霉营养缺陷型突变株

以亚硝酸诱变处理黑曲霉Ｎ３４３和黑曲霉ＵＶ－１１的分生孢子，然后将它们培养在完全培养基平板上至第二代分生孢子长出，收集这些孢子以制霉菌素浓缩处理，结果以３．８～０．３％的高频率得到１９株稳定的营养缺陷型突变株：从黑曲霉Ｎ３４３获得３株维生素类的缺陷型，它们分别为双缺或叁缺；从黑曲霉ＵＶ－１１获得１６株特殊的脯氨酸营养缺陷型，进一步分析表明这是由于从谷氨酸合成脯氨酸或精氨酸的代谢阻断所致。所有以上突变株形态与各自原养型相似。

酵母原生质体融合的研究

本文报道了酵母原生质体的制备、再生及融合过程.培养亲株对数生长早期的细胞(浓度为2.5×10~7细胞/ml),在1.5-2%蜗牛酶及0.1%β-巯基乙醇的作用下,45-60分钟后,原生质体的形成率可达99-100%,在35%聚乙二醇(分子量为6000)和10mMCaCl_2溶液的作用下进行融合实验,可得融合率为2.6×10^(-6)-2.1×10^(-7),它是自发回复突变率的100-1000倍.

辐照诱发木耳营养缺陷型突变的研究

本文用^(60)Coγ射线10—200krad辐照木耳单核担孢子,获得9株营养缺陷型菌株,其中光木耳[Auricularia auricula(L.ex Hook)Underw.]8株,琥珀木耳[Auricularia fuscosucinea(Mont.)Farlow.)1株,诱变频率为2.38×10^(-3)-44.4×10^(-3)。辐照诱变有效剂量,光木耳为200krad,琥珀木耳为10krad。突变体生理生化研究表明,突变体的菌落形态、菌丝生长速度、氨基酸含量、酯酶同工酶酶谱等均发生了变异。

里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型转化体系改进和β-葡萄糖苷酶的过量表达

里氏木霉是广泛应用于纤维素酶生产的工业真菌,但高产突变株遗传操作困难,限制了菌种改良。首先利用定点整合策略敲除里氏木霉突变株QM9414的pyr4基因,成功构建尿嘧啶营养缺陷型菌株QP4,其遗传转化效率显著提高,而且产酶能力不受影响。进一步在QP4中过量表达β-葡萄糖苷酶(BGL)基因bgl1,经大量平板显色筛选获得2株BGL活力明显增强的工程菌QPB4和QPB5,其酶活分别提高10.01倍和8.26倍。利用发酵酶液对2种不同预处理的玉米芯底物进行水解糖化实验,结果显示以酸处理玉米芯为底物时QPB4和QPB5的葡萄糖得率比QP4分别提高60.98%和52.44%,而以脱木素处理玉米芯为底物时其葡萄糖得率分别提高80.01%和86.00%。研究表明改进里氏木霉高产突变株遗传转化体系可以显著促进菌株改良,提高糖化应用效果。

木耳营养缺陷型原生质体再生方式研究

以单核木耳营养缺陷型菌株为试材,观察了原生质体再生方式及其比率。结果表明:原生质体再生方式包括四大类12种。即:(1)直接发芽再生,包括3种,占43.5%;(2)间接发芽再生,包括3种,占21.7%;(3)直接一间接同时发芽再生,包括4种,占26.1%;(4)裂殖生长不发芽再生,包括2种,占8.7%。

炭疽芽孢杆菌A16R株lysA基因缺失突变株的构建

目的构建炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)A16R株lysA基因缺失突变株,为后续的定量蛋白质组学研究奠定基础。方法以炭疽杆菌活疫苗A16R株lysA基因为目的缺失基因,利用软件设计上下游同源臂以及抗性基因的引物,用同源重组酶将3个片段连入质粒中,构建重组质粒,并将重组质粒导入炭疽杆菌A16R感受态细胞中,筛选炭疽杆菌A16R株lysA基因缺失突变株,对其进行验证。最后绘制缺失突变株和野生株生长曲线并进行生理生化分析。结果成功构建了重组质粒,经同源重组后获得lysA基因缺失突变株。鉴定表明目的基因已经丢失。结论成功获得炭疽杆菌A16R株lysA基因缺失突变株,为定量蛋白质组学研究奠定了基础,也为炭疽杆菌重要基因功能的研究建立了良好的技术平台。

光木耳和琥珀木耳种间营养缺陷型原生质体融合研究

利用^(60)Co—γ射线辐照木耳担孢子,获得了9株营养缺陷型突变体。采用光木耳[Auricularia auricula(L,ex Hook.)Underw.]组氨酸缺陷型菌株Aa-γH-9和琥珀木耳[Auricularia fuscosucinea(Mont.)Farlow]腺嘌呤缺陷型菌株Af-γH-1进行种间原生质体融合实验,根据营养互补原理,在基础培养基(MM)上检出融合子,获得了稳定的融合子,融合子频率为3.34×10^(-4)—3.76×10^(-4)。初步遗传分析表明:融合子细胞核为单核,是单核异核体,融合子氨基酸含量、酯酶同功酶酶谱均与双亲不同。

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。