不同源性大肠杆菌多药耐药基因AcrA、AcrB部分基因的同源性分析

通过聚合酶链式反应从不同源性大肠杆菌的染色体DNA上扩增出大肠杆菌多药耐药基因AcrA、AcrB的部分片段 ,将该片段分别连接到克隆载体pMD_18T的BamHI、XhoI酶切位点中 ,测定插入片段的核苷酸序列 ,并分别推导出其氨基酸序列。序列分析表明 :不同源性大肠杆菌的AcrA的部分基因的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GeneBank中该基因序列的同源性较高 ;不同源性大肠杆菌的AcrB的部分基因的核苷酸序列的同源性较低 。

鼠伤寒沙门菌cpxR和acrB双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

为了探索cpxR基因对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控机制,同时避免外排泵acrB的存在掩盖cpxR对其他外排泵或外膜蛋白的调控作用,利用基于Red同源重组系统的一步法失活染色体基因,用含有同源臂的线性打靶DNA片段替换目的基因,构建鼠伤寒沙门菌JS株的acrB基因缺失株JSΔacrB。然后利用噬菌体转导技术,以前期构建的cpxR缺失株JSΔcpxR∷kan为供体菌,本研究新构建的JSΔacrB为受体菌,在P22噬菌体的作用下构建双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan,同时制备cpxR基因回补菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR。最后用微量稀释法测定10种临床常用代表性抗菌药物对JS和各缺失株的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,成功构建鼠伤寒沙门菌的双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan以及其cpxR基因互补菌株JSΔacrBΔcpxR/pcpxR。MIC结果显示,acrB基因缺失后,多西环素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松和头孢噻呋的MIC值分别降低32、4、4、16、32、4、2和128倍;双基因缺失后,多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的MIC值进一步降低2、8、2和2倍;而将cpxR基因回补之后,这4种抗菌药物的MIC值会升高4、16、2和4倍。结果表明,cpxR能调控鼠伤寒沙门菌对多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的敏感性。

大肠杆菌多重耐药基因AcrA、AcrB内标准DNA的构建

在克隆AcrA、AcrB部分基因片段并进行基因及编码蛋白的同源性分析的基础上,设计合成构建AcrA、AcrB的内标准DNA所需引物,经过3次(12个)PCR成功地合成了AcrA、AcrB的内标准DNA。合成法构建定量RT-PCR内标准DNA快捷、成功率高。

福氏志贺菌主动外排基因acrB的克隆与序列分析

以福氏志贺菌2a型菌株基因组为模板，经PCR扩增得acrB基因，将该基因克隆到pMD18-T Vector载体，将重组质粒进行PCR和酶切鉴定及序列测定．结果表明：测定序列与Genbank收录的福氏志贺菌参考序列同源性为99．7％，与大肠杆菌的acrB基因序列比较分析，序列同源性在98％～99％之间，说明志贺菌主动外排基因acrB在碱基序列和编码的氨基酸序列上均与大肠杆菌有很高的同源性，它可能是志贺菌引起多重耐药的主要原因．

鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB双基因缺失株相关耐药基因的RNA-seq分析

应用转录组测序技术(RNA-seq)筛选鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB相关的靶基因,为鼠伤寒沙门菌耐药机制的深入研究奠定基础。采用RNA-seq技术分析baeSR和acrB基因缺失后表达量变化的相关耐药基因,通过GO富集和KEGG通路探索其主要功能,qRT-PCR验证部分差异基因。以|log2(Fold Change)|>1且q value<0.005为条件,其中以CR△acrB和CR为比较组,共筛选到1320个差异表达基因,894个下调,426个上调;以CR△baeSR△acrB和CR为比较组,共筛选到1377个差异表达基因,972个下调,405个上调。GO富集分类结果显示差异基因主要集中在跨膜运输、细胞黏附、纤毛或鞭毛运动等功能;KEGG数据库显示,差异基因主要富集在代谢途径、ABC转运系统、双组份信号转导系统、鞭毛组装、β-内酰胺抗性等通路。其中,ompR、csgD、fliA、fliG可通过调节细菌生物膜形成能力调控其对多种抗生素的耐药性;emrA、mdtC、yejE属于外排泵相关基因,可介导细菌对黏菌素、新生霉素等的耐药性;STM3031可赋予沙门菌头孢曲松抗性;pmrF可参与调节细菌对多粘菌素的抗性。鼠伤寒沙门菌acrB和baeSR基因缺失可影响相关耐药基因的表达。

鼠伤寒沙门菌BaeSR和AcrB双基因缺失株的构建及其耐药性分析

【目的】构建鼠伤寒沙门菌BaeSR和AcrB双基因缺失株,探究BaeSR和AcrB对鼠伤寒沙门菌耐药性的影响。【方法】采用自杀质粒pLP12介导的同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌标准株CR的AcrB基因缺失株CR△AcrB以及AcrB和BaeSR双基因缺失株CR△BaeSR△AcrB,比较分析鼠伤寒沙门菌缺失株与标准株对氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋、阿米卡星、安普霉素、四环素、强力霉素、阿奇霉素、恩诺沙星、环丙沙星、氟苯尼考、氯霉素12种药物的敏感性及生长特性、生物膜形成能力、运动性等生物学特性差异。【结果】成功构建了鼠伤寒沙门菌标准株CR的基因缺失株CR△AcrB和CR△BaeSR△AcrB。药物敏感性结果显示,与标准株CR相比,CR△AcrB对12种药物的MIC值均有不同程度的降低;与CR△AcrB相比,CR△BaeSR△AcrB对除青霉素类(氨苄西林和阿莫西林)以外的10种药物MIC下降了50%~87.5%。与标准株CR相比,CR△AcrB和CR△BaeSR△AcrB的生长速率无明显变化,但其生物膜形成能力(P<0.01)及运动性(P<0.05)均显著下降。【结论】鼠伤寒沙门菌AcrB和BaeSR基因缺失后,细菌的运动性及生物膜形成能力显著下降,对多种抗生素的敏感性增强。