一种启动子克隆的改良Adaptor-PCR方法及在橡胶树上的应用实例

真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用实现基因的转录调控,而启动子区域含有多种顺式元件,作为基因表达调控网络的枢纽控制着基因转录的起始与效率,一直是基因表达调控研究的重点[1]。本文提供了一种改良的基于Adaptor-PCR启动子克隆方法,改进了接头序列,设计了适合两步法PCR的接头引物。选取了25种限制性内切酶对橡胶树基因组DNA进行酶切,在所有酶切产物都平端化后,与改进的接头连接,成功构建了以Adaptor-PCR为基础的橡胶树基因启动子克隆文库,并利用此文库成功克隆了橡胶树6个蔗糖转运蛋白基因、1个转化酶基因和1个海藻糖合酶基因的启动子。本文研究结果为橡胶树基因启动子克隆提供了一个高效平台,也为其他生物基因启动子克隆提供了有益的参考。

用衔接头PCR克隆新的胡萝卜Ⅱ型转化酶基因启动子

为克隆新的胡萝卜 型转化酶基因启动子 ,将胡萝卜基因组 DNA分别用 Pvu 、Eco R 、Dra 和 Sma 酶切 ,酶切片段与一特殊的衔接头连接 .取连接产物作模板 ,以衔接头引物和基因特异引物做 PCR,得到的主要 PCR产物分别为 3.4kb、1 .3kb、0 .4kb和 0 .6kb.将 Eco R -衔接头体系的 PCR产物克隆和测序 ,并将其序列与 Gen Bank中的已知序列进行比较分析 ,发现了一个新的胡萝卜 型转化酶启动子序列 ,它含有类似于 TATA box和 CAAT box的元件 ,在启动子的远上游区域还含有多个 AT富含区 .该启动子的发现对于研究植物中糖代谢具有重要意义 .

Pseudomonas putida GM6多聚磷酸盐激酶(ppk)基因的克隆及表达

以一株高效聚磷菌Pseudomonas putidaGM6为研究材料。为获得其多聚磷酸盐激酶(polyphos-phate kinase,ppk)基因,并验证该基因在磷酸盐转运系统中的作用,根据已报道的ppk基因保守区域设计引物,从其总DNA中成功扩增到ppk基因的部分片段(约528 bp)。随后采用快速染色体步移方法(Self-formed adap-tor PCR,SEFA-PCR)技术扩增片段的上下游基因序列,将三个序列拼接,用OMIGA软件分析其ORFs,推测ppk基因全长为2 220 bp(GenBank accession number DQ133537)。构建的多聚磷酸盐激酶表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET29a-ppk经IPTG诱导后3 h时,明显出现分子量约为81 kDa的表达产物。且表达菌株在12 h时的磷去除率高达80%(对照菌株的磷去除率仅为18%),远高于已报道的40%的去除率。这表明ppk基因在E.coli中的过量表达,导致了E.coli菌体中poly-P的大量聚集,从而大大去除了培养基中的磷酸盐。

灵芝漆酶基因转录Cu^(2+)诱导特性及其启动子的克隆与序列分析

以Cu2+为诱导物检测了灵芝漆酶同工酶基因的转录特性,并对其启动子进行了克隆及序列分析。研究发现:灵芝漆酶基因在Cu2+的作用下表达量出现明显差异,其中以在发酵液中添加3.0 mmol.L-1Cu2+、诱导时间为6 d时,漆酶基因的mRNA表达量最高。根据GenBank中已报道的灵芝漆酶基因的序列信息,经PCR扩增获得了灵芝漆酶5′端长879bp的基因特异序列,进而通过self-formed adaptor PCR(SEFA-PCR)方法,扩增得到灵芝漆酶基因起始密码子上游长832bp的启动子序列。分析表明,该启动子区域除分布有TATA-box、CAAT-box及GC-box等基本的转录起始元件外,还存在多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括4个MRE元件、4个STRE元件、11个HSE元件和5个氮因子结合位点等。

2种PCR技术扩增微分离的蚕豆染色体

用接头介导的PCR (polymerasechainreaction ,LA PCR)和简并寡核苷酸PCR(DOP PCR)2种技术对微分离的蚕豆 (viciafaba)大M染色体进行了扩增 ,并对扩增结果及 2种PCR技术的优缺点进行了比较 .结果表明 ,LA PCR的扩增产物大小为 0 .3～ 3kb ,而DOP PCR的扩增产物大小为0 .3～ 1.3kb .LA PCR的对照中未观察到扩增产物 ,而DOP PCR的对照中却明显观察到扩增产物 ,此扩增产物是由于引物之间相互退火而形成的二聚体或更高级的聚合体 .LA PCR的Southern杂交信号明显强于DOP PCR ,可见LA PCR的扩增效率明显高于DOP PCR .

利用YADE法进行棉花基因组PCR步行

设计了一种依靠“Y”形接头延伸未知序列的方法 (YADE ,Y shapedAdaptorDependantExtension) ,成功地抑制了在未知序列扩增中的单引物扩增。用这种方法从棉花基因组中扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F0 2 7的相邻序列———F0 2 7S和F0 2 7A。重叠分析表明 ,F0 2 7S与F0 2 7有 10 4bp的重叠 ,F0 2 7A与F0 2 7有 175bp的重叠。两个延伸片段分别含有 1和 3个可能的内含子 ,内含子均具有保守的边界序列GT -AG和与哺乳动物类似的分枝点序列。还对YADE法扩增未知序列的优缺点和可能的改进作了进一步讨论。

利用多模板Y形接头延伸法进行相邻序列的连续扩增(英文)

Y形接头延伸法(Y-shaped adaptor dependent extension,YADE)是一种扩增已知DNA片段相邻序列的方法,但其效率常受到已知序列周围酶切位点数目的限制。在Y形接头延伸中采用由多种酶切和连接产生的DNA作模板,大大提高了该方法扩增相邻序列的效率,实现了相邻序列的连续扩增。利用该方法通过2轮连续的扩增从7种酶切连接产物中成功地获得了1个棉花小GTP酶基因(GhRacB)的2228bp上游序列。结果表明,多模板Y形接头延伸法是一种从复杂基因组中扩增相邻序列的有用方法。

仔猪腹泻抗性相关特异表达ESTs的筛选(英文)

以久仰香猪、剑白香猪和长白猪 3个品种的脾脏为材料 ,以品种间同一组织不同的发病状态为对照 ,将DDRT PCR技术与银染法相结合进行差异显示研究 ,筛选与仔猪腹泻抗性相关的特异表达ESTs。在脾脏未发病RNA池中检测到 5条特异表达ESTs ,其中一条与Nck转导蛋白同源 ,一条与长散布元件反转录酶同源 ,一条为相似性较高的未知功能序列 。

几种差别表达基因显示技术及其在植物方面的应用

９０年代以来，先后出现了ＤＤ、ＲＤＡ、ｃＤＮＡ－ＲＤＡ、ＳＡＧＥ、ＧＥＦ、ＲＦＤ、ＳＳＨ以及ＡＴＡＣ－ＰＣＲ等数种未知产物的差别表达基因显示技术。本文对这些技术的异同、各自的优缺点以及它们在植物方面的应用现状和前景作了简单综述。

假单胞菌DLL-E4尿黑酸降解基因的克隆与功能的初步分析

通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变子中筛选到1株在LB培养基上积累红褐色物质的突变株M18,该突变株不能以L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine, Phe)为唯一碳源生长。SEFA-PCR扩增转座子侧翼序列发现其与已报道的尿黑酸1,2-双加氧酶基因hmgA的同源性为92%。将hmgA定向克隆至表达载体pET-29a中,转化至Escherichia coli BL21,经IPTG诱导后可表达分子量约为48kD的蛋白;诱导后转化子粗酶液对尿黑酸有很好的降解效果。将hmgA连入自杀性载体pEX19Gm,通过同源重组整合至M18染色体中,使其恢复了DLL-E4利用Phe的能力,证实了HmgA是尿黑酸苯环裂解酶。

应用接头PCR的方法扩增假attP位点

φC31整合酶可高效介导外源基因特异、稳定地与哺乳动物基因组发生重组反应,基因组中被整合的位点为假attP位点.运用接头PCR的方法对φC31整合酶介导的含有attB序列及表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体在牛基因组中的一个新的特异整合位点(假attP位点)进行扩增,并且显示接头PCR技术在克隆与已知序列相邻的未知旁侧序列上其具有高效、特异、灵敏等特点.

应用接头PCR克隆慢病毒介导的转基因小鼠整合位点旁侧序列

目的为鉴定慢病毒介导的转基因小鼠中外源基因的整合位点信息，应用接头PCR克隆整合位点旁侧序列。方法小鼠基因组总DNA酶解后与设计的接头片段连接，根据慢病毒的LTR序列设计巢式PCR引物，克隆转基因小鼠整合位点旁侧序列。结果成功克隆到转基因小鼠整合位点的旁侧序列，经过测序定位于小鼠染色体上。结论作为反向PCR的改进，本方法可用于转基因小鼠整合位点旁侧序列的克隆，为分析整合位点与外源基因表达之间的关系等提供了科学依据。