人脂肪组织来源基质干细胞成脂分化及Ad-EGFP体外转染研究

目的探讨重组腺相关病毒载体能否有效地转染脂肪组织来源基质干细胞及(ADSC)其影响,同时为组织工程寻找一种理想的病毒载体及细胞示踪标记方法。方法采用抽脂法分离培养ADSC,诱导培养液诱导细胞成脂分化,行细胞形态学检查,细胞表面抗原鉴定,油红O染色,评价细胞成脂情况。在此基础上转染Ad-EGFP,观察细胞形态学改变及荧光表达的时间与强度,计算转染效率,确定转染的理想感染复数(MOI)值,同时通过活力和增殖实验进行Ad-EGFP体外转染对ADSC的影响研究。结果细胞扩增迅速,形态良好,经诱导后呈现明显的成脂改变。实验确定Ad转染细胞的较佳MOI值为50,以此值转染Ad-EGFP后细胞荧光持续高效稳定表达,并可传至子代,可以满足示踪标记的需要。Ad转染效率高,对细胞活性影响小。结论ADSC的培养和分化能满足脂肪组织工程的要求;Ad长期稳定表达目的基因,是一种理想的组织工程病毒载体;基因转染方法高效稳定表达EGFP,可作为种子细胞良好的示踪标记方法。

Complexin-1/2过表达重组载体对阿尔茨海默病小鼠记忆损伤的实验研究

目的构建Complexin-1/2(CPLX-1/2)基因的重组腺相关病毒过表达载体p AAV-CPLX-1/2并研究其在阿尔茨海默病记忆损伤中的作用。方法将用Oligo 7软件对Genbank上小鼠CPLX-1/2m RNA的CDS两端序列进行分析,合成CPLX-1/2基因,构建过表达载体并转化至大肠杆菌Top10;选取正确的克隆进行PCR和测序鉴定。重组腺相关病毒载体测序正确后,转染AAV293细胞,包装腺相关病毒。将重组腺相关病毒经脑立体定位注射到三转基因阿尔茨海默病(3XTg-AD)小鼠海马CA3区,经免疫组化和Western-Blot检测CPLX-1/2蛋白表达情况,水迷宫检测CPLX-1/2过表达对3XTg-AD小鼠记忆的影响。结果 PCR及测序结果表明成功构建了含小鼠CPLX-1/2基因的重组腺相关病毒表达载体。CPLX-1/2在海马CA3表达显著增加。CPLX-1/2过表达显著改善3XTg-AD小鼠的记忆损伤。结论本研究成功构建了CPLX-1/2重组腺相关病毒过表达载体并在整体动物水平成功高效表达;CPLX-1/2过表达可显著改善3XTg-AD小鼠空间记忆的损伤。为在整体动物水平深入研究CPLX-1/2的功能提供了新的手段;研究结果提示CPLX-1/2可能作为AD记忆损伤治疗的关键靶点。

不同病毒载体感染内耳组织的比较研究

目的通过血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒感染大鼠内耳组织的比较研究，筛选出更适合内耳基因治疗的病毒载体。方法一定体积的血清5型重组腺病毒液和血清2型重组腺相关病毒液经圆窗膜注入鼓阶外淋巴液，通过荧光共聚焦显微镜、免疫组化、Western免疫印迹及听性脑干反应等方法对两种载体所携带报告基因的表达部位、表达时程以及两种病毒本身对内耳组织细胞生活状态的影响加以比较。结果血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒所携带的增强型绿色荧光蛋白报告基因均可在前庭膜、血管纹、基底膜、盖膜、螺旋神经节区及转染对侧耳表达。rAAV2携带的EGFP蛋白第14天表达开始明显增多，第60天仍可检测到高表达。rAd5携带的EGFP蛋自在耳蜗组织内的表达高峰维持在第1～21天，在30天时表达明显减弱。结论腺病毒的优势在于其基因表达的迅速和高效，而腺相关病毒载体以其长的表达时程，低组织细胞毒性在内耳基因转染中表现出独特的优势。

重组腺相关病毒介导克老素基因表达对2型糖尿病大鼠肾脏纤维化的作用及其机制

目的观察重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导的克老素(klotho,KL)基因表达对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠肾脏纤维化的影响及其机制。方法将SD大鼠随机分为4组,随机选3组建立T2DM大鼠模型,分别经尾静脉注射rAAV.mKL(T2DM-mKL组)、rAAV.GFP(T2DM-GFP组)和PBS(T2DM-PBS组),正常对照(SD-PBS组)大鼠经尾静脉注射PBS,12周后,处死动物,收集肾脏组织标本,冰冻切片观察GFP,Masson染色观察肾脏组织病理变化及胶原纤维表达;免疫组化法检测各组大鼠肾脏组织中KL和波形蛋白(vimentin,VIM)的表达;RT-PCR法检测各组大鼠肾脏组织中Rho激酶(Rho associated coiled-coilforming protein kinase,ROCK)基因mRNA转录水平;Western blot法检测各组大鼠肾脏组织中ROCKⅠ蛋白活性。结果 T2DM-GFP组、T2DM-mKL组大鼠肾脏组织中GFP表达较强;T2DM-mKL组大鼠肾小球基底膜结构较清晰完整,肾小球系膜区及肾小管间质区胶原纤维明显较T2DM-PBS组和T2DM-GFP组减少;T2DM-mKL组KL蛋白的表达明显高于其他各组(P<0.01),VIM蛋白的表达明显低于其他各组,与T2DM-PBS组和T2DM-GFP组VIM蛋白的表达相比,差异有统计学意义(P<0.01);T2DM-mKL组ROCKⅠmRNA转录水平及其蛋白活性均明显低于T2DM-PBS组(P均<0.05)。结论 rAAV.mKL转染可明显增加T2DM大鼠肾脏中KL基因的表达,延缓糖尿病肾纤维化进程,其机制可能与KL抑制ROCK信号通路活性相关。