Nuclear transfer using nonquiescent adult fibroblasts from a bovine ear

The natural reproduction of mammal is sexual reproduction, which needs fertilization involving sperm and oocyte. Nuclear transfer provided an asexual reproduction method for mammal. Donor cells used in previous experiments of nuclear transfer were mostly from undif-ferentiated or non-terminally differentiated cells, such as embryonic or fetal cells. However, since Wilmut et al. obtained a viable lamb by transfer of an adult sheep somatic cell into

简易灌注装置同时提取成年小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞

目的简化Langendorff灌注装置,并且同时提取成年小鼠心肌细胞(AMCM)和心脏成纤维细胞(AMCF)用于实验。方法采用简易灌注装置进行成年小鼠主动脉逆行灌注,同时提取AMCM和AMCF。对其进行形态学观察,并分别通过L-苯肾上腺素(PE)和转化生长因子(TGF)-β1刺激诱导AMCM肥厚和AMCF向肌成纤维细胞分化,以评估其生物学功能。结果复钙后耐钙杆状AMCM占比(62.65±3.12)%,并且可以在体外培养超过1周,与对照组相比,PE刺激后AMCMβ-肌球蛋白重链、心钠肽蛋白表达水平显著升高(P<0.05),杆状AMCM长宽比显著缩小(P<0.05)。AMCF纯度较高,在体外可以传代3~4次,与对照组相比,TGF-β1刺激后AMCF Collagen I、Collagen III、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平显著升高(P<0.05)和荧光强度显著增强(P<0.05)。结论简易灌注装置可以简单、稳定、高效地同时提取满足实验需求、具备生物学功能的AMCM和AMCF。

供体核种类对水牛核移植效果的影响

采用电融合法和直接注射法进行核移植,以比较不同来源和不同类型水牛供体细胞的核移植效果。当用电融合法进行核移植时,成体耳部成纤维细胞的融合率(46.0%)、卵裂率(53.9%)和囊胚发育率(10.9%),均显著低于胎儿成纤维细胞(64.5%,70.1%和21.6%)、胎儿皮肤细胞(71.5%,70.8%和22.1%)以及卵巢颗粒细胞(88.2%,79.1%和25.5%);后三种细胞间的卵裂率和囊胚发育率无显著差异,但卵巢颗粒细胞的融合率显著高于胎儿成纤维细胞和胎儿皮肤细胞(P<0.05)。当用直接注射法进行核移植时,胎儿皮肤细胞注核后的存活率(78.2%)、卵裂率(41.6%)均显著低于成体耳部成纤维细胞(88.6%和57.4%)和胎儿成纤维细胞(85.8%和65.0%)。胎儿成纤维细胞注核后的卵裂率和囊胚发育率(23.3%)均显著高于胎儿皮肤细胞(10.1%)和成体耳部成纤维细胞(12.0%)。结果表明:(1)采用直接注核法进行核移植时,胎儿成纤维细胞作为核供体较为合适,而采用电融合法进行核移植时,用颗粒细胞作核供体更为适宜;(2)胎儿成纤维细胞的核移植效果好于成体成纤维细胞。

电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究

目的采用电穿孔方法，介导质粒载体pEGFP-cl转入兔成体成纤维细胞，探讨建立电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的基本条件。方法电穿孔介导质粒载体pEGFP—cl转入7．10代兔耳成体成纤维细胞系GG，研究不同电压、电容、DNA剂量，孵育温度的条件下，观察细胞存活数，流式细胞仪测试GFP的含量。结果以PBS作为电击基础液、细胞浓度2×10^6个／ml，电压250V、电容700μF，DNA用量30μg时，兔耳成纤维细胞的转染率和存活率最佳。且电击前冰浴10min，电转染后37℃孵育10min有利于提高细胞的转染率和存活率。结论在合适电压、电容、DNA剂量条件下，电转染提供了外源基因转染兔耳成体成纤维细胞适用性；电转染前的一定时间冰浴和电转染后一定温度孵育可使电转染效率得到改善。

成年小鼠心脏成纤维细胞的分离、纯化和原代培养

目的探讨并建立成年小鼠心脏成纤维细胞原代培养方法。方法采用0.8 g/LⅣ型胶原蛋白酶和1 g/L胰蛋白酶为消化液,以多次短时间水浴振荡的方式消化成年小鼠心脏组织,差速贴壁法分离纯化心脏成纤维细胞。波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞类型及纯度;倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线;CCK-8法测定细胞增殖能力、Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)刺激后细胞SMAD家族成员2/3(Smad2/3)蛋白及磷酸化水平。结果差速贴壁后在相差显微镜下可见大量球形贴壁细胞;3 d后细胞逐渐由圆形伸展为长梭形并迅速增殖,分裂象多见;5 d后细胞数量显著增多,完全汇合无空隙;细胞生长曲线近似"S"形。波形蛋白阳性率可达95%。CCK-8法显示在第3~5天细胞增殖能力最显著,给予第2代心脏成纤维细胞TGF-β1刺激显示Smad2/3蛋白磷酸化水平明显增加。结论建立了一种快速、经济、有效获取成年小鼠心脏成纤维细胞的方法。

胎儿和成人皮肤及其创面愈合过程中碱性成纤维细胞生长因子的表达及意义

目的 探讨胎儿和成人皮肤及其创面愈合过程中碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)的表达及其意义。方法 将孕龄 2 0～ 2 4周胎儿皮肤移植至 BAL B/ C裸鼠背部皮下 ,皮片成活后制造创面 ,建立胎儿无瘢痕愈合动物模型 ,定期获取相应标本。对临床所取正常成人皮肤及创面愈合皮肤标本 ,采用免疫组织化学染色方法 ,观察 b FGF的表达情况。 结果 正常胎儿皮肤及创伤后胎儿皮肤中均未见明显的 b FGF阳性表达。正常成人皮肤中血管周围可见阳性表达 ;创伤后成人皮肤也可见阳性表达 ,尤其成纤维细胞和血管内皮细胞创伤后表达明显增强。高倍镜视野随机观察计数b FGF阳性表达细胞数 ,正常胎儿皮肤为 2 .1± 0 .1,创伤后 12小时 ,1、3天和 1周胎儿皮肤分别为 2 .2± 0 .1、2 .1± 0 .3、2 .1± 0 .3和 2 .0± 0 .1;正常成人皮肤为 2 3.2± 4 .2 ,创伤后成人皮肤为 4 0 .5± 3.6 ,胎儿正常皮肤和创伤皮肤 b FGF表达与正常成人皮肤和创伤后皮肤 b FGF表达比较 ,差异有统计学意义 (P<0 .0 1)。 结论 b FGF的阴性表达可能是胎儿皮肤无瘢痕愈合的重要原因之一。

供体细胞培养处理方法对水牛核移植效果的影响

以经常规培养法 (DMEM+10 % FCS)、血清饥饿法 (DMEM+0 .5 % FCS培养 5～ 10 d)和 Apidicolin- APD结合血清饥饿法 (0 .1mg/ L APD培养 2 4 h,DMEM+0 .5 % FCS培养 1～ 18d)培养处理的水牛卵巢颗粒细胞和水牛成体耳部成纤维细胞作供核 ,分别采取带下注核法和胞质内注核法进行核移植。同一供核细胞各处理组间的核移植胚融合率 (以颗粒细胞作供核 )以及重组胚的囊胚发育率无明显差异 (P>0 .0 5 ) ,但经 APD+0 .5 % FCS培养处理供体细胞核移植后的分裂率显著高于其他组 (P<0 .0 5 )。用 7%乙醇处理的成体耳部成纤维细胞进行核移植 ,其重组胚的分裂率和囊胚发育率与对照组 (不含乙醇 )均无明显差异 (P>0 .0 5 )。结果表明 ,(1)血清饥饿处理水牛供体细胞对其核移植效果没有影响 ;(2 ) DNA合成抑制剂 APD结合血清饥饿培养处理水牛颗粒细胞和成体耳部成纤维细胞 ,可提高其核移植效果 ;(3)乙醇预激活处理水牛成体耳部成纤维细胞 。

鲁西黄牛体细胞克隆保种技术的研究

以体外培养的鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞作核供体,研究利用体细胞克隆技术保存我国地方黄牛优良品种的技术方法。通过组织块培养法建立的鲁西黄牛(1♂,4♀)成纤维细胞系,作为核移植供体细胞,利用屠宰场母牛卵巢卵母细胞经体外培养成熟后作为核受体进行核移植,试验结果表明:重构胚的融合率为62.5%(242/387),分裂率为63.6%(154/242),体外培养第7天囊胚发育率为42.9%(66/154)。体外培养第7天的囊胚的内细胞团细胞(ICM)与滋养层细胞数平均为37和47,ICM占44.2%。体外发育到7 d的囊胚新鲜胚胎的移植妊娠率(新鲜胚胎)移植受体10头,60 d妊娠率为20%(2/10)。

供体细胞种类对牛核移植效果的影响

供体细胞种类对牛卵母细胞核移植效果影响的研究结果表明,颗粒细胞的核移植效果与成年牛成纤维细胞无显著差异(19.8%vs 17.3%,P>0.05);胎牛成纤维细胞核移植囊胚发育率高于成年牛成纤维细胞(24.2%vs 14.0%,P<0.05);血清饥饿处理的胎牛成纤维细胞(休眠细胞)与高血清培养(非休眠细胞)的胎牛成纤维细胞核移植效果差异不显著(18.8%vs 18.6%,P>0.05),表明胎牛成纤维细胞血清饥饿处理没有必要。

成年小鼠心成纤维细胞的原代培养及生物学特性

目的:建立适用于成年小鼠心成纤维细胞的体外分离培养及鉴定的技术方法。方法:应用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶联合消化法及组织贴块法两种方法对小鼠心成纤维细胞进行体外培养。在倒置显微镜下观察心成纤维细胞生长情况;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种方法获得的心成纤维细胞的增殖情况;观察不同培养基对心成纤维细胞生长的影响;苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态,采用免疫荧光染色观察培养细胞波形蛋白、纤维连结蛋白及盘状结构域受体2(DDR2)的表达。结果:酶联合消化法分离培养的细胞1 d后,在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3 d后生长迅速呈长梭形;贴块法培养的细胞4 d后,可见细胞从组织块边缘长出,7 d后细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为97%。两种方法获得的第3代细胞生长曲线近似"S"形、MTT法显示3～5 d细胞增殖较明显;酶联合消化法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为62.61%和30.87%,组织贴块法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为69.24%和28.05%;含100 mL/L胎牛血清的HG/DMEM培养基培养的细胞出现明显对数期。两种方法培养的第3代细胞行苏木素-伊红染色可见细胞漩涡状排列,免疫荧光检测波形蛋白、纤维连接蛋白及盘状结构域受体2表达阳性。结论:两种方法均可高效获得心成纤维细胞在体外稳定培养。与贴块法培养相比较,利用联合酶消化法能较有效的获得波形蛋白、纤维连结蛋白、DDR2高表达阳性的心成纤维细胞。

生长因子促成年兔关节软骨细胞增殖的研究

目的 研究促进成年兔关节软骨细胞迅速增殖的方法。方法 将体外培养 2 4～ 2 8月龄的新西兰大白兔的原代关节软骨细胞中加入不同浓度的胰岛素样生长因子 - (IGF- )、碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)及 IGF- +b FGF联合应用。于 2 4、4 8及 72小时分别进行 MTT检测软骨细胞的成活数 ;检测传 3代后各组软骨细胞的总增殖倍数 ;第 14天后 ,用流式细胞仪检测各组软骨细胞的增殖倍数 ,观察 IGF- 、b FGF及 IGF- +b FGF联合应用对成年兔关节软骨细胞各时间点的促增殖作用。结果 1施加不同浓度的 IGF- 、b FGF或两者联合应用后各时间点软骨细胞活细胞数明显高于对照组 (P<0 .0 1) ;2传 3代后 ,三组总增殖倍数也都明显高于对照组 (P<0 .0 1) ,且两种因子联合应用 ,增殖倍数明 显比应用单个因子时高 ,有统计学意义 (P<0 .0 1) ;3培养 14天后 ,增殖指数明显高于对照组 (P<0 .0 1) ,两种因子联合应用时 ,增殖指数明显比应用单个因子时高 (P<0 .0 5 ) ;而施加两次因子时 ,增殖指数比施加一次因子时高 (P<0 .0 5 )。结论 IGF- 、b FGF对成年兔关节软骨细胞有明显的促增殖作用 ,两者之间有协同效应。

HGF+FGF4体外定向诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化的特征性表型鉴定

目的 探索人骨髓来源多能成体祖细胞 (hMAPCs)在肝细胞生长因子 (HGF) +成纤维生长因子 4 (FGF 4 )诱导下分化为肝细胞的可行性 ,为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法 取健康成人适量骨髓 ,采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞并行贴壁培养 ,获取骨髓间充质干细胞(MSCs) ,将MSCs通过CD4 5、GlyA免疫微磁珠负分选得到hMAPCs;将获取的hMAPCs用HGF(2 0ng/ml) +FGF 4(10ng/ml)进行诱导分化 ,L 0 2人肝细胞株为阳性对照 ,未加任何诱导因素的hMAPCs为阴性对照 ;免疫细胞化学染色鉴定不同诱导分化阶段细胞的ALB、AFP、CK 18、CK 19等肝细胞特征的表型变化 ,并计数阳性细胞比率 ;Westernblot检测诱导分化第 2 1天、35天后细胞的ALB表达。结果 ALB、CK 18在诱导组中基本为阳性着色 ,CK 19均为阴性着色 ,AFP仅在诱导第 7天有阳性着色。在诱导分化第 2 1天、35天 ,ALB均有阳性表达。

成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性

目的:建立一种周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法,并探索其生物学特性。方法:取8~12周龄BALB/c小鼠背部、尾尖、耳部皮肤,配制2种血清的细胞培养液,采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养,通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度;通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别。结果:背部皮肤组织块贴壁使用Gibco胎牛血清培养7 d无细胞游出,CLARK特级胎牛血清细胞游出较多。背部皮肤经酶消化法得到细胞贴壁少;经组织块贴壁法细胞生长慢,培养周期长;酶消化组织块贴壁法细胞游出速度快、数量多、呈长梭形。尾尖取材量少,得到细胞少;耳部皮肤取材方便,但细胞纯度低。CCK8增殖曲线呈S型;相较于对照组,UVB辐照后细胞凋亡率增高17%。结论:CLARK特级胎牛血清、背部皮肤取材、酶消化组织块贴壁法是培养成年小鼠原代皮肤成纤维细胞最优的方案,可增加细胞得量、缩短培养周期,降低成本。

成人巨细胞成纤维细胞瘤

报告1例成人巨细胞成纤维细胞瘤。患者男,72岁。8年前无明显诱因左下肢出现红色皮下结节,有轻度压痛,7年前经组织病理诊断为软组织来源恶性肿瘤,未予治疗。皮损缓慢增大,并形成多个外生性结节、肿瘤,皮损面积约8 cm×10 cm。再次行组织病理学检查,结果示真皮和皮下胶原间弥漫性瘤细胞增生。肿瘤细胞为梭形,部分细胞体积巨大或呈多核形态,细胞异形性明显。肿瘤局部有黏液沉积,血管周围淋巴细胞浸润。免疫组化示肿瘤细胞波形蛋白阳性,角蛋白AE1/3、S-100蛋白、结蛋白、肌动蛋白、平滑肌肌动蛋白及CD31均为阴性。CD34染色示第1次切片肿瘤细胞阴性,第2次切片浅部肿瘤细胞阳性,深部肿瘤细胞阴性。结合临床、组织病理及免疫组化特点诊断为成人巨细胞成纤维细胞瘤。

体外培养成人包皮成纤维细胞周期同步化效果检测

供体细胞和受体胞质周期协调性是核移植胚胎发育的关键,对人成体细胞的细胞周期分布及其同步化效果进行探讨,将为人治疗性克隆研究打下基础。结果发现:80%￣85%汇合生长成人包皮成纤维细胞G0/G1期细胞比例显著高于接种后第1天指数生长细胞及接种后第5天100%汇合生长细胞两组(67.0%vs58.2%,52.8%,P<0.05),指数生长状态下,仍有58.2%的成人包皮成纤维细胞处于G0/G1期;以0.2μg/ml和2μg/ml不同浓度阿菲迪霉素(aphidicolin,APD)处理成人包皮成纤维细胞24h,2μg/mlAPD组G0/G1期细胞比例显著高于0.2μg/ml组和对照组(10%FBS)(82.9%vs68.8%,63.5%,P<0.05),2μg/mlAPD可有效的将成人包皮成纤维细胞同步于G0/G1期,且培养液中添加10%、0.5%、0%FBS不同浓度血清对2μg/mlAPDG0/G1期同步化效果无显著影响(82.6%vs81.8%vs74.6%,P>0.05);以血清饥饿培养法(0.5%FBS)进行成人包皮成纤维细胞同步化处理,血清饥饿处理3d组G0/G1期细胞比例显著高于0d组(对照组)(71.8%vs59.6%,P<0.05),血清饥饿培养3d可有效将细胞同步于G0/G1期。因此,2μg/mlAPD处理24h和血清饥饿培养3d可有效将成人包皮成纤维细胞同步于G0/G1期。

重庆市区健康成人碱性成纤维生长因子血清浓度测定

目的：了解重庆市区健康成人不同年龄段和不同性别间碱性成纤维生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）清浓度水平．为研究疾病状态下人体血清bFGF的浓度变化提供有益的参考数据。方法：随机选取重庆市区90名健康成人血清标本．其中青年组（18—45）岁，中年组（46～60）岁，老年组（〉60岁）各30例，采用ELISA方法测定bFGF浓度，将所测值在各年龄组、性别组之间行统计学比较。结果：90名健康成人血清bFGF的浓度平均值为（31．24±15．80）pg／ml；老年组浓度显著低于青、中年组，男性、女性均如此（尸均〈0．05），余不同年龄、性别之间未见统计学差异。结论：重庆市区老年人bFGF血清浓度显著降低，男、女性均如此。

改良联合酶消化法提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞

目的探讨改良联合酶消化法是否能稳定提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞。方法 6只C57成年小鼠拉颈处死后取心脏,然后采用改良联合酶消化法即用胰酶、Ⅱ型胶原酶于37℃恒温箱内消化心脏组织6 min,加血清终止消化,然后将含有细胞的消化液冰上储存,离心提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞,传代后采用苏木素-伊红染色及免疫荧光法检测波形蛋白、盘状结构域受体2进行形态学和免疫学鉴定。结果采用改良联合酶消化法可以稳定地提取贴壁细胞。苏木素-伊红染色可见细胞呈梭形,贴壁生长;经免疫荧光鉴定,所提取的细胞波形蛋白、盘状结构域受体2表达阳性。结论改良联合酶消化法可以稳定地提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞。

成年大鼠心房成纤维细胞分离与培养方法的建立

目的探索成年大鼠心房成纤维细胞体外分离及纯化培养的方法。方法无菌条件下将大鼠心房组织剪成1mm3大小组织块,经心肌消化液(溶液终浓度为0.8g/L胰蛋白酶和0.4g/LⅡ型胶原酶混合液)多次消化,收集分离的大鼠心房成纤维细胞,通过差速贴壁分离方法纯化原代成纤维细胞,细胞生长接近于次融合状态下进行传代。倒置显微镜下观察细胞生长及形态学特点,免疫荧光法进行细胞鉴定。结果刚消化分离下来的细胞呈亮球形,轮廓清晰,单个散在或聚集成团分布,差速贴壁70min后即有大量细胞贴壁,其中细胞部分已开始伸展,轮廓逐渐模糊。4~5d可形成单层细胞,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形。免疫荧光染色发现其抗波形蛋白(Vimentin)与抗胶原受体-2(DDR2)染色阳性,抗vWF及抗α-SMA染色阴性,鉴定为成纤维细胞。结论混合酶消化法是成年大鼠心房成纤维细胞分离培养的简便有效的方法。

环状RNA hsa_circUCK2参与调控二氧化硅致肺纤维化进程

[背景]肺纤维化疾病目前早期缺少筛查诊断方法,后期缺乏特效治疗措施,因此急需探究其机制并开发针对性的治疗方法。[目的]筛选病理条件下差异表达的环状RNA(circRNA)hsa_circUCK2的表达情况,探究其对肺纤维化的影响。[方法]在细胞实验中,使用小干扰RNA(siRNA)敲除HPF-a细胞中hsa_circUCK2,TGF-β1刺激HPF-a细胞,设立si-NC组、si-circUCK2组、si-NC+TGF-β1处理组、si-circUCK2+TGF-β1处理组4组,Western blot法检测4组HPF-a细胞中纤连蛋白(FN1)表达情况,划痕实验检测HPF-a细胞迁移能力,CCK-8实验检测TGF-β1刺激的2组(si-NC+TGF-β1处理组和si-circUCK2+TGF-β1处理组)HPF-a细胞活性。在动物实验中,健康SPF级雄性C57BL/6小鼠48只,随机分为生理盐水+si-con组,生理盐水+si-circ_0000115组,SiO_(2)+si-con组,SiO2+si-circ_0000115组4组。mmu_circ_0000115是hsa_circUCK2的小鼠同源基因,气管滴注siRNA敲除小鼠肺circRNA mmu_circ_0000115,48 h后通过气管滴注SiO2悬液(0.2 g·kg^(-1),50 mg·mL^(-1))构建小鼠肺纤维化模型,实时荧光定量PCR检测小鼠各脏器中敲除效率,Western blot检测肺组织中I型胶原α2蛋白(COL1A2)表达情况,天狼星红检测肺组织中胶原合成情况。[结果]在细胞实验中,Western blot结果显示,敲除hsa_circUCK2可下调TGF-β1刺激的HPFa细胞中FN1的表达水平(P <0.05);CCK-8实验和细胞划痕实验结果显示,hsa_circUCK2基因的下调可以抑制HPF-a细胞的增殖和迁移(P <0.01)。在动物实验中,实时荧光定量PCR结果显示,在各脏器中只有肺组织中被显著敲除mmu_circ_0000115(P <0.000 1);Western blot结果表明,与SiO2+si-con组相比,敲低mmu_circ_0000115可以降低COL1A2蛋白表达水平(P <0.000 1);天狼星红结果显示,敲低mmu_circ_0000115后,模型组小鼠肺组织中胶原的产生和沉积减少。[结论]敲低hsa_circUCK2抑制成纤维细胞活化和减少肺纤维化模型小鼠中胶原沉积。提示hsa_circUCK2参与肺纤维化进程,可能是肺纤维化的潜在治疗靶点。

成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案

目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法。方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08%胰酶+0.1%胶原酶II消化15 min,B:0.2%胶原酶II消化15 min,C:0.2%胶原酶II消化60min,D:0.2%胶原酶II消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞。采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定。结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3 d即可传代。72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97%。台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳。结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型。