中华鳖爆发性传染病研究 Ⅳ.不同生化类型嗜水气单胞菌aer基因的PCR比较

用PCR技术对 5 2株不同来源和不同毒力的鳖源嗜水气单胞菌的aer基因进行了比较和分析。结果表明 ,b、d、e和 g四种生化型的嗜水气单胞菌含有特异的 2 0 9bp片段 ,而c和f两种生化型和其他鳖源致病菌却呈阴性反应 ,显示并非所有的嗜水气单孢菌都有aer基因 (产生气溶素 )。

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构。根据G enB ank中aer毒素的基因序列(M 16495),设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pM D 18-T载体克隆。酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M 16495的同源性达92%,将测得的序列登录G enB ank数据库,所得的序列编号为AY 136943。分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示:其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M 16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%。证明aer毒素基因的5′端保守,3′端变异较大。

框镜鲤致病性维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测框镜鲤致病性维氏气单胞菌(A.veronii)双重PCR方法,本研究以A.veronii CY0806株和国际标准株DNA为模板,分别以16S rRNA和Aer基因特异性引物进行PCR扩增,分别获得大小约880 bp和430 bp的DNA片段。通过序列比对分析,16S rRNA基因片段、Aer片段序列与GenBank中登录的A.veronii ATCC35624株的的同源性均为99%。进一步试验显示该方法的敏感性较高,达到1.58×10-3ng/μL,特异性较强,只有A.veronii标准株及分离株结果呈阳性;人工模拟污染样本试验显示:该方法的检出率达到了86.7%,高于细菌分离培养的70%检出率。双重PCR检测方法的建立,为框镜鲤致病性A.veronii的检测提供新的方法。

嗜水气单胞菌毒力因子检测及不同毒力基因型菌株对剑尾鱼的致病性研究

选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)的4种主要胞外毒力因子(气溶素、溶血素、胞外蛋白酶和细胞毒性肠毒)设计合成4对引物,对2008—2009年广东、江西两省的临床分离菌株进行检测,评价菌株毒力基因的分布特征及其毒力强弱。60株临床分离株中,具有4种毒力基因(aer+hly A+epa+act+)的菌株占58.33%(35/60),是主要毒力基因型;其他25株的毒力基因有不同数量缺失。不同基因型的代表菌株对剑尾鱼攻击试验结果表明,嗜水气单胞菌毒力因子之间表现出协同作用,aer+hly A+epa+act+型的毒力最强,对剑尾鱼的致死率最高。