传统 BCG 初免 IL-12联合 Ag85A DNA 疫苗加强序贯免疫小鼠效果观察

目的探讨BCG初次免疫,IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强免疫对小鼠的免疫效果。方法实验小鼠随机分为7组,即PBS阴性对照组、BCG组、pcAg85A组、BCG初免pcAg85A加强免疫组、BCG初免pcAg85A联合IL-12加强免疫组、BCG初免IL-12加强免疫组、以及BCG初免pcDNA3.1加强免疫组。按BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA加强的免疫程序进行免疫实验,在末次免疫后的4、6、8周通过检测小鼠血清总IgG抗体、特异性淋巴细胞增殖,细胞因子的水平,观测对小鼠的免疫效果。结果采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强的免疫策略组的小鼠与其它免疫方式组相比,IgG明显升高(P<0.05)、特异性淋巴细胞明显增殖,加强免疫后IFN-γ水平、IL-2水平、IL-4水平BCG/Ag85A+IL-12组在3个时间段分别为128.2±20.4、190.2±16.51、244.2±39.14;146.2±17.29、271.6±16.36、419.3±28.12;68.6±6.62、96.6±5.5、117.4±10.71均高于其它各组(P<0.05)。结论采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强的免疫能明显增强机体体液和细胞免疫,为进一步在动物体内进行保护性效应试验的研究提供了依据。

BCG初次免疫联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强免疫效果的研究

为探讨BCG初次免疫,结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强免疫的序贯免疫策略对小鼠的免疫效果。采用BCG及结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗依次免疫小鼠,在末次免疫后的4、6、8周通过检测小鼠血清总IgG抗体、特异性淋巴细胞增殖,细胞因子的水平,观测BCG初次免疫,Ag85ADNA疫苗加强免疫的策略对小鼠的免疫效果。结果显示,采用BCG初次免疫,结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强免疫的策略组的小鼠与其它免疫方式组相比,IgG明显升高(P<0.05)、特异性淋巴细胞明显增殖、IFN-γ、IL-2、IL-4水平明显增高(P<0.05)。由此可知,在采用BCG初次免疫,结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强的免疫策略后,能增强对小鼠的免疫效应,尤其是Th1型细胞免疫反应增强明显,为进一步在动物体内进行保护性效应试验的研究提供了实验依据。

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。

结核杆菌Ag85B-DNA与H37Ra序贯免疫小鼠后细胞免疫的探讨

[目的]探讨用结核分枝杆菌Ag85B-DNA(pTB30m)和结核菌H37Ra序贯免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫。[方法]用碱裂解法制备Ag85B成熟蛋白的真核表达质粒(pTB30m),初次免疫小鼠2周后,用H37Ra皮内加强免疫(DNA-85B/H37Ra组),同时设定Ag85B-DNA/BCG组、H37Ra组、BCG组及未免疫组。加强免疫4w和8w后,检测小鼠脾淋巴细胞被PPD刺激指数(SI)及其IFN-γ、IL-2的表达水平。[结果](1)酶切鉴定pTB30m所含外源基因片段大小正确,纯度较高。(2)DNA-85B/H37Ra组小鼠脾淋巴细胞的SI均显著高于H37Ra组、BCG组和DNA-85B/BCG组(P﹤0.05);(3)所有免疫组IFN-γ及IL-2表达与未免疫组比较,差异有统计学意义(P﹤0.05),DNA-85B/H37Ra组与DNA-85B/BCG组均高于H37Ra组和BCG组(P﹤0.05),DNA-85B/H37Ra略高于DNA-85B/H37Ra,但差异无统计学意义(P﹥0.05)。[结论]DNA-85B/H37Ra序贯免疫效果略优于DNA-85B/BCG组,明显优于H37Ra组和BCG组。

分枝杆菌胞壁融合表达Ag85B-ESAT-6穿梭质粒的构建

目的 :构建E .coli. BCG(BacilleCalmette Guerin)穿梭载体 ,在母牛分枝杆菌细胞壁融合表达结核分枝杆菌 (MTB)的分泌蛋白Ag85B ESAT 6 .方法 :用聚合酶链反应 (PCR)从MTB毒株H37Rv基因中扩增出结核分枝杆菌 190 0 0抗原 (19 ss)胞壁区及其上游调控元件基因 ,克隆入E .coli. BCG穿梭载体pOLYG中 ,构建表达蛋白能嵌入细胞壁中的E .coli. BCG穿梭载体 .用间接免疫荧光染色法观察该载体携带所构建的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B和ESAT 6基因在母牛分枝杆菌宿主中的融合表达 .结果 :经测序证实所克隆的 19 ss基因序列正确 ,所构建的E .coli. BCG穿梭载体 (pCW)能完成在大肠杆菌和母牛分枝杆菌细胞之间的穿梭 ,经免疫荧光检查外源基因Ag85B ESAT 6可融合表达于分枝杆菌宿主表面 .结论 :本方法可成功构建能够在分枝杆菌胞壁融合表达MTB分泌蛋白Ag85B ESAT 6的E .coli. BCG穿梭质粒 .

Ag85B与MPT64DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的 研究Ag85B与MPT6 4DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的免疫保护效果。方法 C5 7BL/ 6小鼠 5 4只 ,采用随机数字表法随机分为 6组 ,分别用磷酸盐缓冲液 (PBS)、pcDNA3 1(+)、卡介苗 (BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT6 4、pcDNA/Ag85B +pcDNA/MPT6 4经肌肉注射法免疫小鼠 ,0、3、6周各 1次 ,即PBS组、pcDNA3 1组、BCG组、pcDNA/Ag85B组、pcDNA/MPT6 4组及pcDNA/Ag85B +pcDNA/MPT6 4组。BCG组只在 0周予皮内注射卡介苗 1次。末次免疫后第 5周用 1×10 6CFU的H3 7Rv经尾静脉实施攻击 ,攻击后 6周处死部分小鼠 ,用酶联免疫吸附测定 (ELISA)法检测血清总IgG、纯化蛋白衍生物 (PPD)特异性脾淋巴细胞干扰素γ(IFN γ)和白细胞介素 4 (IL 4 )分泌水平 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定特异性脾淋巴细胞增殖 ;作脾、肺组织荷菌量和病理学检查 ,并观察小鼠存活时间。结果 PBS组肺和脾器官荷菌量分别为lg-1(7 85 4± 0 0 0 3)CFU/g和lg-1(7 190±0 0 16 )CFU/g、pcDNA3.1组分别为lg-1(7 70 0± 0 0 16 )CFU/g和lg-1(7 0 72± 0 0 6 8)CFU/g、BCG组分别为lg-1(6 4 4 9± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(5 4 36± 0 0 4 2 )CFU/g、pcDNA/Ag85B组分别为lg-1(7 370± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(6 4 2 96± 0 0 0 9)

分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗菌株的筛选

目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗(BCG)菌株。方法采用多聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60(Hsp60)基因及其信号肽序列αss,将测序正确的hsp60和αss基因分别克隆入大肠杆菌(E.coli.)BCG穿梭载体pOLYG中,构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22,按相应的酶切位点将ag85b和esat6按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体,分别命名为pDE22Ag85B ESAT6和pDE22ESAT6Ag85B,将纯化的重组质粒电穿入BCG,经潮霉素抗性筛选和PCR的方法鉴定出含目的基因的重组BCG阳性克隆。收集重组BCG的培养上清液,经浓缩和透析后,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和固相化蛋白质免疫学测定(Western blot法)分析。结果两株重组BCG菌株的培养上清液分泌表达相对分子质量约37000的蛋白,且分别可与抗Ag85B和抗ESAT6蛋白免疫小鼠的血清有相应的结合条带。结论分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组BCG菌株构建成功,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。

新型重组卡介苗的免疫原性研究

结核病是一种慢性消耗性人畜共患病,不仅严重影响人类的身体健康,还对畜牧业造成惨重的经济损失。卡介苗是目前官方唯一认可使用的疫苗,但仅对儿童具有较好的保护力;部分国家也将卡介苗应用于动物结核病的预防中。但效果一般。本研究以小鼠为实验模型,对前期通过基因工程方法构建的增强型重组卡介苗GM-CSF-Ag85B-Rv3872-CFP10-ESAT6-BCG的免疫效果进行了评价,证实了该候选疫苗对小鼠的安全性,且能够产生针对BCG外源蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫,对结核病具有一定的保护作用。

卡介苗穿梭表达质粒pMS肿瘤坏死因子的构建与鉴定

目的 构建分泌性表达肿瘤坏死因子(TNF) α的重组卡介苗。方法 分别以卡介苗(BCG)和TNF αcDNA为模板,通过PCR扩增得到117bp的BCG Ag85B信号肽序列和70 2bp的TNF α基因序列。将BCG Ag85B信号肽序列插入大肠杆菌 卡介苗穿梭质粒pMV2 61,得到重组质粒pMS。再将TNF α基因序列克隆至pMS中,得到重组质粒pMSTNF。结果 质粒pMSTNF用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因BCG Ag85B和TNF α正确插入载体pMV2 61。结论 重组质粒pMSTNF可望在BCG中分泌性表达细胞因子TNF α,从而协同加强对肿瘤的杀伤作用,该质粒的成功构建为改造卡介苗。