基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产...基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产量提高到1 g/L。其次,对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化,目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1诊断试剂盆的开发提供了参考。展开更多
目的:获得尘螨变应原第6组分Der f 6原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE结合率。方法:酶切质粒p ET28a(+)-Der f 6获得目的基因Der f 6,将其与p ET32a(+)载体连接成质粒p ET32a(+)-Der f 6,转化BL21细菌后,用异丙基...目的:获得尘螨变应原第6组分Der f 6原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE结合率。方法:酶切质粒p ET28a(+)-Der f 6获得目的基因Der f 6,将其与p ET32a(+)载体连接成质粒p ET32a(+)-Der f 6,转化BL21细菌后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni+离子亲和层析柱纯化表达产物,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹实验(Western blot)和蛋白质串联质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定纯化产物。以纯化获得的产物为包被抗原建立间接ELISA法检测尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体反应情况。结果:成功构建了原核表达质粒p ET32a(+)-Der f 6,将该质粒转化E.coli BL21诱导表达,亲和层析纯化后,SDS-PAGE显示获得目的蛋白,Western blot验证其能够与载体的组氨酸标签结合,质谱鉴定其Der f 6结构一致。以此产物为包被抗原建立间接ELISA检测尘螨过敏性哮喘患儿血清,阳性率为41.3%(19/46)。结论:成功构建了原核表达质粒p ET32a(+)-Der f 6,亲和纯化获得的目的蛋白具有良好的反应原性。展开更多
目的本文建立食品中鲍鱼过敏源基因成分实时荧光PCR检测方法。方法采用蛋白酶K消化法提取鲍鱼肌肉组织中基因组DNA,针对鲍鱼管家基因16S r RNA基因设计特异性引物和探针,确定实时荧光PCR反应体系和反应条件,建立了鲍鱼过敏源基因成分实...目的本文建立食品中鲍鱼过敏源基因成分实时荧光PCR检测方法。方法采用蛋白酶K消化法提取鲍鱼肌肉组织中基因组DNA,针对鲍鱼管家基因16S r RNA基因设计特异性引物和探针,确定实时荧光PCR反应体系和反应条件,建立了鲍鱼过敏源基因成分实时荧光PCR快速检测方法。选用鱿鱼、海参等海产品进行特异性试验;采用添加方法制备灵敏度试验样品,分别制备了鲍鱼过敏源基因成分含量分别为100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%的样品。结果对非鲍鱼类食品进行检测,结果显示出良好的特异性;灵敏度试验表明,本文建立方法的最低检测下限为0.01%。结论本文建立了特异性好,灵敏度高的鲍鱼过敏源基因成分检测方法。展开更多
目的构建尘螨1类变应原ProDer f 1和ProDer p 1基因的改组文库,并筛选出编码优势T细胞表位和低B细胞表位的嵌合基因。方法 PCR扩增ProDer f 1和ProDer p 1基因,等量(V/V)混合PCR产物,DNaseⅠ酶切200s,回收50～150bp的基因片段,进行3轮...目的构建尘螨1类变应原ProDer f 1和ProDer p 1基因的改组文库,并筛选出编码优势T细胞表位和低B细胞表位的嵌合基因。方法 PCR扩增ProDer f 1和ProDer p 1基因,等量(V/V)混合PCR产物,DNaseⅠ酶切200s,回收50～150bp的基因片段,进行3轮无引物PCR,以此为模板分别用ProDer f 1和ProDer p 1基因的特异性引物进行有引物PCR,切胶回收与ProDer f 1和ProDer p 1基因大小相当的基因,连接pUCm-T载体,并转化E.coli DH-5α,涂LB板(Amp+)37℃过夜培养,随机挑取单克隆菌落进行PCR验证,100个阳性克隆测序并进行序列比对及T细胞和B细胞表位预测。结果 ProDer f 1特异性引物扩增并筛选出10个改组明显的重组基因,生物信息学分析显示:与野生型变应原相比,6个重组子的T细胞表位增加,B细胞表位减少;而ProDer p 1特异性引物扩增的基因未发生明显交换。结论应用DNA shuffling技术成功构建尘螨变应原ProDer f 1基因的嵌合文库,并筛选出了编码优势T细胞表位、低B细胞表位的嵌合基因。展开更多
目的:克隆粉尘螨变应原第10组分(Der f 10)基因并建立其原核表达体系。方法:提取粉尘螨总RNA,反转录后经套式PCR扩增出目的基因并克隆至pMD19-T载体测序,将测序正确的目的基因插入表达质粒pET28a,转化E.coliBL21(DE3)用IPTG诱导表达,用S...目的:克隆粉尘螨变应原第10组分(Der f 10)基因并建立其原核表达体系。方法:提取粉尘螨总RNA,反转录后经套式PCR扩增出目的基因并克隆至pMD19-T载体测序,将测序正确的目的基因插入表达质粒pET28a,转化E.coliBL21(DE3)用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。结果:RT-PCR扩增获得Der f 10,琼脂糖凝胶电泳见一条约888 bp的条带,与参考序列(GenBank No.EU 106617)同源性高达99.8%。将pET28a(+)-Der f 10质粒转化宿主菌E.coli BL21,SDS-PAGE电泳时出现特异性条带,Western blot表明重组蛋白可与抗His-Tag Mab抗体结合。生物信息学软件预测获得的Der f 10重组体由295个氨基酸组成的疏水性蛋白,相对分子质量为34 233.1 Da,二级结构包括α-螺旋(91.86%)、延伸主链(1.36%)和无规卷曲(6.78%),含有5个原肌球蛋白模序分别位于84～101、120～140、145～173、175～198和231～256氨基酸处。结论:获得了Der f 10编码基因,成功建立其原核表达体系,为生产重组变应原用于临床诊断与治疗奠定基础。展开更多
文摘基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产量提高到1 g/L。其次,对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化,目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1诊断试剂盆的开发提供了参考。
文摘目的:获得尘螨变应原第6组分Der f 6原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE结合率。方法:酶切质粒p ET28a(+)-Der f 6获得目的基因Der f 6,将其与p ET32a(+)载体连接成质粒p ET32a(+)-Der f 6,转化BL21细菌后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni+离子亲和层析柱纯化表达产物,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹实验(Western blot)和蛋白质串联质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定纯化产物。以纯化获得的产物为包被抗原建立间接ELISA法检测尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体反应情况。结果:成功构建了原核表达质粒p ET32a(+)-Der f 6,将该质粒转化E.coli BL21诱导表达,亲和层析纯化后,SDS-PAGE显示获得目的蛋白,Western blot验证其能够与载体的组氨酸标签结合,质谱鉴定其Der f 6结构一致。以此产物为包被抗原建立间接ELISA检测尘螨过敏性哮喘患儿血清,阳性率为41.3%(19/46)。结论:成功构建了原核表达质粒p ET32a(+)-Der f 6,亲和纯化获得的目的蛋白具有良好的反应原性。
文摘目的本文建立食品中鲍鱼过敏源基因成分实时荧光PCR检测方法。方法采用蛋白酶K消化法提取鲍鱼肌肉组织中基因组DNA,针对鲍鱼管家基因16S r RNA基因设计特异性引物和探针,确定实时荧光PCR反应体系和反应条件,建立了鲍鱼过敏源基因成分实时荧光PCR快速检测方法。选用鱿鱼、海参等海产品进行特异性试验;采用添加方法制备灵敏度试验样品,分别制备了鲍鱼过敏源基因成分含量分别为100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%的样品。结果对非鲍鱼类食品进行检测,结果显示出良好的特异性;灵敏度试验表明,本文建立方法的最低检测下限为0.01%。结论本文建立了特异性好,灵敏度高的鲍鱼过敏源基因成分检测方法。
文摘目的构建尘螨1类变应原ProDer f 1和ProDer p 1基因的改组文库,并筛选出编码优势T细胞表位和低B细胞表位的嵌合基因。方法 PCR扩增ProDer f 1和ProDer p 1基因,等量(V/V)混合PCR产物,DNaseⅠ酶切200s,回收50～150bp的基因片段,进行3轮无引物PCR,以此为模板分别用ProDer f 1和ProDer p 1基因的特异性引物进行有引物PCR,切胶回收与ProDer f 1和ProDer p 1基因大小相当的基因,连接pUCm-T载体,并转化E.coli DH-5α,涂LB板(Amp+)37℃过夜培养,随机挑取单克隆菌落进行PCR验证,100个阳性克隆测序并进行序列比对及T细胞和B细胞表位预测。结果 ProDer f 1特异性引物扩增并筛选出10个改组明显的重组基因,生物信息学分析显示:与野生型变应原相比,6个重组子的T细胞表位增加,B细胞表位减少;而ProDer p 1特异性引物扩增的基因未发生明显交换。结论应用DNA shuffling技术成功构建尘螨变应原ProDer f 1基因的嵌合文库,并筛选出了编码优势T细胞表位、低B细胞表位的嵌合基因。
文摘目的:克隆粉尘螨变应原第10组分(Der f 10)基因并建立其原核表达体系。方法:提取粉尘螨总RNA,反转录后经套式PCR扩增出目的基因并克隆至pMD19-T载体测序,将测序正确的目的基因插入表达质粒pET28a,转化E.coliBL21(DE3)用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。结果:RT-PCR扩增获得Der f 10,琼脂糖凝胶电泳见一条约888 bp的条带,与参考序列(GenBank No.EU 106617)同源性高达99.8%。将pET28a(+)-Der f 10质粒转化宿主菌E.coli BL21,SDS-PAGE电泳时出现特异性条带,Western blot表明重组蛋白可与抗His-Tag Mab抗体结合。生物信息学软件预测获得的Der f 10重组体由295个氨基酸组成的疏水性蛋白,相对分子质量为34 233.1 Da,二级结构包括α-螺旋(91.86%)、延伸主链(1.36%)和无规卷曲(6.78%),含有5个原肌球蛋白模序分别位于84～101、120～140、145～173、175～198和231～256氨基酸处。结论:获得了Der f 10编码基因,成功建立其原核表达体系,为生产重组变应原用于临床诊断与治疗奠定基础。
