信使核糖核酸药物递送载体的研究进展

信使核糖核酸(mRNA)作为一类新兴的核酸类药物,在疫苗、免疫治疗、再生医学、基因编辑等方面具有巨大的应用潜力,尤其是2020年全球新型冠状病毒感染疫情极大加速mRNA技术的发展。然而,mRNA带负电,很难进入细胞,且在体内易被先天免疫系统的细胞吞噬或被核酸酶降解,其不稳定性和低递送效率阻碍了广泛应用。因此,需要安全、有效、稳定的递送载体,以保护mRNA不被降解,突破细胞膜障碍,实现细胞内表达。该文系统介绍了基于mRNA药物递送载体的最新研究进展,主要介绍了脂质载体、聚合物载体、多肽载体及病毒载体,并对未来mRNA药物递送载体研究进行展望,以期为mRNA药物递送新载体的研发提供参考。

良、恶性胸水表达癌胚抗原信使核糖核酸——癌胚抗原系统差别的研究

目的 分析癌胚抗原信使核糖核酸 (CEAmRNA)癌胚抗原 (CEA)系统在良、恶性胸水中表达的差别 ,探讨应用CEAmRNA和CEA指标诊断恶性胸水的价值。方法 采集胸水为检测标本 ,其中恶性胸水 92例、良性胸水5 4例。应用反转录 套式 聚合酶链反应 (RT NP PCR)检测CEAmRNA ,应用磁性抗体分离酶联免疫测定 (MAIA)检测CEA。结果 不同胸水表达CEAmRNA和CEA的阳性结果分别为 :良性 5 .6 % (3/ 5 4 )和 7.4 % (4/ 5 4 )、恶性 80 .4 %(74 / 92 )和 5 4 .3% (5 0 / 92 ) ,两者差别具有统计学意义 (P <0 .0 0 1)。指标诊断恶性胸水的特异性和敏感性分别为 :CEAmRNA 94 .4 %和 80 .4 % ,CEA分别为 92 .6 %和 5 4 .3% ,CEAmRNA的敏感性明显高于CEA(P <0 .0 1)。结论 CEAmRNA CEA系统在良、恶性胸水中的表达的差别具有统计学意义 ,可以用作诊断与鉴别诊断恶性胸水的指标。其中 ,CEAmRNA在恶性胸水中的表达率和敏感性比CEA更高 ,有望成为一个新的。

仙贞片对糖尿病大鼠肾皮质终末期糖化终产物及其受体mRNA表达的影响

目的观察仙贞片对糖尿病大鼠肾皮质终末期糖化终产物 (advancedglycationendproducts,AGEs)含量及其糖化终产物特异性受体 (AGE specificcellularreceptor,RAGE)信使核糖核酸 (messengerri bonucleicacid ,mRNA)表达的影响 ,探讨其对糖尿病大鼠肾保护的作用机制。方法采用链脲佐菌素(streptozotocin ,STZ)复制糖尿病持续性高血糖肾损害大鼠模型 ,用荧光测定法和逆转录 -多聚酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction ,RT PCR)技术检测模型大鼠肾皮质AGEs含量及RAGEmRNA的表达 ,与氨基胍作对照。结果实验 12周模型大鼠肾皮质AGEs相对含量及RAGEmRNA表达明显高于正常对照组 (P <0 0 5 ) ,仙贞片及氨基胍治疗组肾皮质AGEs相对含量及RAGEmRNA表达明显低于模型组 (P <0 0 5 ) ,仙贞片与氨基胍组比较差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论仙贞片能减轻糖尿病大鼠肾皮质内AGEs的积聚 ,下调RAGEmRNA的过度表达 ,与氨基胍相近似 ,具有抑制蛋白非酶糖基化的作用 ,可能是其肾保护作用的机制之一。

中药天癸方对雄激素致不孕大鼠下丘脑Leptin受体及神经肽Y mRNA的影响

目的：从基因转录水平探讨中药天癸方对雄激素致不孕大鼠（ASR）肥胖及无排卵的影响。方法：采用α－32P标记瘦素（leptin）受体（OB－R）及神经肽Y（NPY）寡核苷酸探针原位杂交、放射自显影技术结合图像分析，观察中药治疗前后下丘脑弓状核（AR）两种物质mRNA的表达变化。结果：ASR中ARC的NPY基因表达水平明显增加（P＜0．01），OB－R基因表达水平明显降低（P＜0．01），ASR呈肥胖、无排卵状态。用中药天癸方治疗后，NPY基因表达下降，OB－R基因表达上升至正常大鼠水平。结论：ASR肥胖及无排卵可能与NPYmRNA过度表达、OB－RmRNA数目异常有关，中药可调节NPY和OB－RmRNA表达而发挥减肥及促排卵作用。

补肾健脾活血三类复方对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴及CRF基因表达的影响

目的：为从分子水平来阐明药物对肾阳虚证的主要调节点。方法：采用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）化学发光定量法、放射免疫及细胞免疫技术，观察补肾、健脾、活血三类复方分别对下丘脑一垂体一肾上腺一胸腺（ＨＰＡＴ）轴受抑制模型的下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子（ＣＲＦ）ｍＲＮＡ表达、神经内分泌和免疫功能的影响。结果：唯有补肾药可通过提高下丘脑ＣＲＦｍＲＮＡ表达来保护ＨＰＡＴ轴免受外源性皮质酮的抑制；健脾药对免疫系统有直接的促进作用；而活血药对ＨＰＡＴ轴无任何影响。结论：药物对肾阳虚证的主要调节点定位在下丘脑。

心肌缺血时血管内皮生长因子的基因表达

目的：研究缺血对心肌血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因表达的影响。方法：提取正常兔（ｎ＝２）、假手术兔（ｎ＝２）及冠状动脉左旋支结扎后不同缺血时间的兔（ｎ＝６）心肌总核糖核酸（ＲＮＡ），用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ＶＥＧＦ信使核糖核酸（ＶＥＧＦｍＲＮＡ）的表达。结果：正常及缺血兔心肌中均有３．９ｋｂ的ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达，但缺血心肌中表达明显高于正常心肌，心肌缺血３０分钟ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达即已明显增高，并持续增高达４小时。结论：兔心肌中有ＶＥＧＦ基因的基础表达，缺血可致其表达增加。

CEAmRNA和p53蛋白在不同类型肺癌组织的表达

目的探讨CEAmRNA和p53蛋白在不同类型肺癌组织表达的差异,评估应用CEAmRNA和p53蛋白指标诊断肺癌的价值。方法肺癌组织为检测标本,应用反转录套式聚合酶链反应检测CEAmRNA、免疫组化SP法检测p53蛋白。结果CEAmRNA和p53蛋白的阳性率分别为癌组织86.7%(26/30)和46.7%(14/30)、癌旁组织50.0%(15/30)和6.7%(2/30)、边缘组织6.7%(2/30)和0;肺鳞癌90.9%(10/11)和45.5%(5/11)、肺腺癌90.9%(10/11)和54.5%(6/11)、小细胞癌75.0%(6/8)和37.5%(3/8)。结论肺癌组织有较高水平CEAmRNA和p53蛋白的表达,其中CEAmRNA的表达率更高,检测CEAmRNA和p53蛋白有助于肺癌的诊断。

参附汤上调HL60细胞热休克蛋白和糖皮质激素受体mRNA表达及其对细胞存活的影响

目的 :探讨中药方剂参附汤对HL6 0细胞热休克反应时热休克蛋白信使核糖核酸 (heatshockproteinmRNA ,HSPmRNA)和糖皮质激素受体信使核糖核酸 (glucocorticoidreceptormRNA ,GRmRNA)表达及对细胞存活率的影响。方法 :建立细胞热休克模型 ,用动物血清学方法制备参附汤 (SFT)血清 ,用Northernblot分析HSPmRNA和GRmRNA的改变 ,用台盼蓝拒染法观察细胞存活率。结果 :HL6 0细胞热休克反应时GRmRNA明显减少 ,细胞存活率下降 ,HSPmRNA则增加 ;该细胞经SFT处理后在热休克反应时 ,GRmRNA表达增加 ,细胞存活率提高 ,HSPmRNA进一步增加。结论 :SFT可上调HL6 0细胞热休克反应时HSPmRNA和GRmRNA表达 ,提高糖皮质激素的生物学效应和抗细胞损伤能力 ,从而提高HL6 0细胞在热休克时的存活率 ,这可能是临床上SFT用于治疗失血性休克的机制之一。

乙型肝炎患者自身抗体与外周血CD5^+B细胞、CD5mRNA变化的关系

目的 探讨乙型肝炎 (乙肝 )患者产生的各种自身抗体与外周血CD5 + B细胞百分率和B细胞CD5mRNA水平之间的关系。方法 用ELISA测定乙肝患者类风湿因子 (RF)、抗核抗体 (ANA)、抗心磷脂抗体 (ACA)、抗肝细胞膜特异性脂蛋白抗体(抗LSP)、抗亲环素A抗体 (抗CyPA)、抗钙调素抗体 (抗CaM) ;用免疫组化法检测CD5 + B细胞、RT PCR法检测CD5mRNA。结果 慢性乙肝 (慢肝 )、慢性重症乙肝 (慢重肝 )、肝炎后肝硬化 (肝硬化 )患者ACA、抗CyPA、抗CaM水平与CD5 + B细胞百分率和CD5mRNA水平呈正相关。结论 CD5 + B细胞参与乙肝的慢性化和严重化病程 。

更年健对老年雌性大鼠下丘脑、垂体和卵巢雌激素受体mRNA的影响

目的:观察中药复方更年健对老年雌性大鼠下丘脑、垂体和卵巢雌激受体(ER)和 ER mRNA 的影响。方法:建立自然衰老的雌性大鼠模型,用放射配体结合分析法检测 ER,用 Norther blot 分析 ER mRNA 的改变。结果:雌性大鼠性减退期下丘脑,垂体和卵巢ER 和 ER mRNA 水平随血清雌二醇(E_2)水平的下降较性成熟期显著下降,而更年健则使下降了的 ER 和 ER mRNA 水平明显提高。结论:本结果提示更年健在临床上治疗更年期综合征的机理可能是在不改变 E_2水平的情况下,提高下丘脑、垂体和卵巢 ER 和 ER mRNA 水平,从而增强雌激素的生物学效应,改善临床症状和体征。

活血利水法对外伤性PVR兔眼玻璃体FNmRNA表达的影响

目的:探讨活血利水法对外伤性增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)纤维连接蛋白信使核糖核酸(FNmRNA)的影响。方法:用兔眼后节穿通伤加注入血浆法制备PVR模型,利用免疫组化法对正常组、模型组、活血利水组、活血化瘀组、利水明目组PVR中的玻璃体腔增殖膜FNmRNA进行检测。结果:活血利水组增殖膜中FNmRNA的阳性表达低于模型组、活血化瘀组和利水明目组(P<0.05)。结论:活血利水法能够降低PVR增殖膜中FNmRNA的阳性表达,抑制PVR的发生发展。

体复康对运动性疲劳大鼠脑组织中阿黑皮素原基因表达动态变化的影响

目的 :从基因转录水平阐明运动性疲劳产生及药物调节的机理。方法 :采用生物素标记阿黑皮素原 (POMC)cRNA探针 (Bio cRNA)原位杂交法结合图像分析 ,观察中药复方体复康对运动性疲劳大鼠不同脑区POMCmRNA表达。结果 :对于慢性运动应激 ,体复康能增强POMC在海马CA1 区、下丘脑部位的基因表达 ,而能降低POMC在额叶皮层的基因表达。长时期 (共 7周 )大强度的跑台运动 (速度由 1 5m/min递增至 3 5m/min ,运动时间为每天 2 0～2 5min)的大鼠 ,末次运动后POMC基因表达在额叶皮层、海马CA1 下降 (前者至运动结束后 3h仍未恢复 ,后者至运动结束后 3 0min即恢复 ) ,在下丘脑则增强 ;体复康能增强末次运动后POMC在额叶皮层、海马CA1 区、下丘脑等脑区的基因表达 ,尤其是在运动结束后 3h最为显著。结论 :POMCmRNA表达在运动性疲劳大鼠不同脑区呈现不同的动态变化趋势 ,体复康对其POMCmRNA表达有重要动态调节作用。

检测组织标本癌胚抗原信使核糖核酸指标诊断肺癌

目的 探讨检测癌胚抗原信使核糖核酸 (CEA mRNA)在肺癌诊断与鉴别诊断中的应用价值。方法 应用反转录套式聚合酶链反应 (RT PCR)技术 ,检测 3 2例肺癌组织和 1 1例肺良性疾病肺组织标本中的CEA mRNA表达水平。结果 3 2例肺癌组织中CEA mRNA阳性者 2 7例 (84.4% ) ,而对照组 1 1例均为阴性。检测CEA mRNA诊断肺癌的特异性为 1 0 0 % ,敏感性为 84.4%。结论 采用RT PCR技术检测肺癌组织中CEA mRNA有助于肺癌的诊断与鉴别诊断 。

应用荧光标记信使核糖核酸差异显示技术分离子宫肌瘤相关基因片段

目的:应用荧光标记的信使核糖核酸(messengerribonucleicacid,mRNA)差异显示技术分离子宫肌瘤及正常子宫肌组织相关的差异基因片段。方法:用4种锚定引物和3种随机引物,共12种组合,结合GenomyxLRTMDNA差异显示系统及GenomyxSCTM荧光图像扫描系统,以及配套的FluoroDDandHI-EROGLYPHmRNAProfile试剂盒,采用荧光标记的mRNA差异显示技术进行子宫肌瘤及正常子宫肌组织相关差异基因片段的分离。结果:从子宫肌瘤及正常子宫肌组织间分离出相关的差异基因片段27条,差异片段中主要表现为条带密度的强弱差别。结论:子宫肌瘤的产生可能与某些基因表达的差异有关,而差异基因的序列及功能有待进一步研究。

胆红素脑病仔鼠脑组织神经元特异性烯醇化酶mRNA及其蛋白的动态变化

目的观察胆红素脑病仔鼠脑组织神经元特异性烯醇化酶(NSE)mRNA及其蛋白的变化,探讨其生物学机制和对胆红素脑病的诊断价值。方法选取新生7日龄清洁级Wistar大鼠120只,随机分为对照组和实验组,各60只,每组再按6个时间点(6、12、24、48、72、96h)分为6组,每组10只。对照组仔鼠腹腔注射9g/L盐水0.5mL,实验组仔鼠腹腔注射胆红素溶液200mg/kg制成胆红素脑病模型。应用反转录-聚合酶链反应技术检测胆红素脑病仔鼠不同时间点脑组织NSEmRNA表达;应用免疫组织化学方法检测不同时间点海马区、皮质区、丘脑区及苍白球区脑组织NSE蛋白阳性表达。结果实验组大鼠脑组织NSEmRNA表达自6h开始明显下降,与对照组比较均有显著性差异。造模后6h其海马区脑组织NSE蛋白阳性表达下降,实验各组与对照组比较无显著性差异;其皮质区脑组织NSE蛋白阳性表达6～96h均明显下降,与对照组比较均有显著性差异;造模后6h其丘脑区脑组织NSE蛋白阳性表达开始下降,实验组6、12、48、96h与其对照组比较均无显著性差异,而24、72h与其对照组比较有显著性差异;苍白球区脑组织NSE蛋白阳性表达6～96h明显下降,与对照组比较均有显著性差异。结论NSEmRNA的变化同其蛋白的变化趋势一致,是判定胆红素脑病的可靠神经生化指标之一。

人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA表达水平与宫颈病变病理级别的相关性分析

目的探讨人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA表达水平与宫颈病变病理级别的相关性。方法选取宫颈病变患者500例,收集宫颈口及宫颈管的脱落细胞行E6/E7 mRNA定量检测,阴道镜下宫颈多点取活组织病理检查,根据病理学结果明确诊断并进行分组,分析E6/E7 mRNA表达量与宫颈病变病理级别的关系。结果共228例患者E6/E7 mRNA阳性,检出率为45.6%。在炎症组、宫颈上皮内瘤变(CIN)组及癌组中,E6/E7 mRNA阳性检出率随组织学诊断的严重程度增高而升高(P<0.05)。宫颈高级别组(≥CINⅡ)E6/E7 mRNA阳性检出率为78.75%,明显高于宫颈低级别组(≤CINⅠ)的24.76%(P<0.05)。不同病理诊断组间E6/E7 mRNA基因表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05),E6/E7 mRNA基因表达量与宫颈病变病理级别呈正相关(P<0.05)。结论 E6/E7 mRNA癌基因表达量随着宫颈病变病理级别升高而升高。

外周血AFPmRNA、h-TERTmRNA检测对肝细胞肝癌患者预后的意义

目的检测肝细胞肝癌(HCC)患者外周血甲胎蛋白信使核糖核酸(AFPmRNA)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达,探索其在HCC预后中的应用价值。方法FQ-PCR检测60例HCC患者外周血中AFPmR-NA、hTERTmRNA的表达量,并与对照组进行比较。结果HCC患者AFPmRNA、hTERTmRNA的表达量及阳性率均高于对照组(P<0.01)。术后随着时间的推移,其表达数量相应减少,阳性率也明显降低,以1周后下降最为显著(P<0.05)。在肿瘤标志物持续表达阳性的患者中,其术后复发率也明显高于阴性者(P<0.01)。结论外周血中定量检测AFPmRNA、hTERTmRNA的表达可以及时发现患者术后HCC的微转移,预测肿瘤的复发倾向,为术后的合理治疗提供依据。

甲胎蛋白异质体和甲胎蛋白信使核糖核酸用于诊断肝细胞癌

目的:探讨联合检测2种血清肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)异质体(AFP-L3)和甲胎蛋白信使核糖核酸(AFPmRNA)诊断肝细胞癌价值及评估肝癌预后的意义。方法:对2005年4-7月收治的82例肝细胞癌(HCC)、11例慢性乙型肝炎肝硬化合并门脉高压和19例肝脏良性肿瘤患者应用酶联吸附法及荧光定量PCR联合检测AFP-L3和AFPmRNA水平,对比其阳性率;并对术后1个月的肝癌患者检测AFP-L3和AFPmRNA水平,统计作出生存曲线。结果:术前不同肿瘤指标的检测结果:AFP-L3联合AFPmRNA检测阳性率为64.3%,明显高于AFP、AFP-mRNA单独检测的阳性率(50.9%、40.2%),差异均有统计学意义(P<0.05);术前、术后AFP-L3联合AFPmRNA检测均阳性的患者术后3年生存率较低。结论:术前联合检测APF-L3和AFPmRNA两项指标可提高HCC、尤其是AFP阴性HCC的诊断率,而术后联合检测又对评估HCC的预后有一定的指导意义。

血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的稳定性研究

目的：探讨血管紧张素 Ⅱ（ＡｕｇⅡ）、环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）对 ＡｎｇⅡ１型（ＡＴ１）受体信使核糖核酸（ｍＲＮＡ）表达的稳定性及心肌细胞蛋白代谢的影响。 方法：３天以内 ＳＤ乳鼠原代培养的心肌细胞，分为对照组（不加刺激因子）、Ａ组（加入放线菌素 Ｄ ５μｇ／ｍｌ）、Ｂ组（加人Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ及ＩＢＭＸ各３０μｍｏｌ／Ｌ）；Ｃ组（加入放线菌素Ｄ ５ μｇ／ｍｌ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ及ＩＢＭＸ各３０ μｍｏｌ／Ｌ），与刺激因子作用后，提取细胞ＲＮＡ，逆转录多聚酶链反应测定ＡＴ１受体ｍＲＮＡ含量。 结果：ＡＴ１受体ｍＲＮＡ半衰期约在 ４．９ 小时，ＡｕｇⅡ、放线菌素Ｄ单独或共同作用心肌细胞 ６ 小时ＡＴ１受体ｍＲＮＡ的表达无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。Ｂ组ＡＴ１受体ｍＲＮＡ的表达与对照组比较具极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。ＡｎｇⅡ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ＋ＩＢＭＸ分别或共同作用心肌细胞 １４４小时，使其蛋白含量分别为对照的 １３３． ３％（与对照比有显著性差异，Ｐ＜０．０５）、９２．８％（与对照比无显著性差异，Ｐ＞０．０５）和１０５．０％（与对照比无显著性差异，Ｐ＞０．０５）。 结论：ＡｎｇⅡ不改变ＡＴ１受体ｍＲＮＡ的稳定性，ｃＡＭＰ?

家兔输精管结扎后睾丸雄激素受体mRNA表达及与血浆睾酮变化关系的研究

３０只日本大耳白雄兔，分为输精管结扎２５月组（ＶＧ２５）和假手术２５月组（ＳＯＧ２５），输精管结扎６月组（ＶＧ６）和假手术６月组（ＳＯＧ６）。应用放射免疫技术测定血浆睾酮含量；应用大鼠雄激素受体（ＡＲ）ｃＤＮＡ探针，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法检测睾丸组织的ＡＲｍＲＮＡ表达，分析输精管结扎对睾丸ＡＲｍＲＮＡ表达强度的影响。结果表明（１）血浆睾酮含量以ＶＧ６为最低（８．０６±２．７８ｎｍｏｌ／Ｌ），但与ＳＯＧ６（１０．６８±０．９９ｎｍｏｌ／Ｌ）比较，Ｐ＞０．０５．ＶＧ２５（１２．１０±２．４４ｎｍｏｌ／Ｌ）略高于ＳＯＧ２５（１０．９３±１．２８ｎｍｏｌ／Ｌ），并显著地高于ＶＧ６（ｔ＝３．０９，Ｐ＜０．０１）。（２）睾丸组织ＡＲｍＲＮＡ的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析证明，家兔睾丸组织的ＡＲｍＲＮＡ与大鼠有同源性，杂交信号位于２８ｓ之后。在ＶＧ６、ＳＯＧ６、ＶＧ２５和ＳＯＧ２５均有ＡＲｍＲＮＡ的表达，ＶＧ６强于ＳＯＧ６，ＶＧ２５与ＳＯＧ２５无明显差异。该结果显示了睾酮对ＡＲｍＲＮＡ表达的下调节作用，而输精管结扎对家兔ＡＲｍＲＮＡ的长度无影响。