金黄色葡萄球菌α-溶血素基因的克隆与序列分析

参考Gary S Gray和Michael Kehce在《传染与免疫》杂志上发表的关于金黄色葡萄球菌α溶血素蛋白的基因序列,设计合成1对引物,从分离自牛体的野生株金黄色葡萄球菌中提取细菌总DNA,对α溶血素蛋白基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现1条约960 bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18 T质粒载体中,进行核苷酸序列分析,然后与报道的α溶血素蛋白基因进行比较。结果表明:所鉴定的野生株金黄色葡萄球菌的α溶血素蛋白基因序列与报道的核苷酸的同源性高达99.99%以上,证实为金黄色葡萄球菌Wood 46株α溶血素蛋白基因。

牛角地黄汤对α-溶血素诱导红细胞溶血的抑制作用研究

[目的]牛角地黄汤是中国传统医学中用于清热解毒凉血化瘀的基础方剂,由水牛角、地黄、赤芍、丹皮、钩藤等主要成分组成。本研究旨在研究分析牛角地黄汤及方剂中主要成分对金黄色葡萄球菌α-溶血素诱导兔红细胞溶血作用的影响。[方法]将牛角地黄汤水煎剂及其各单味中药的水煎剂分别与金黄色葡萄球菌溶血毒素作用不同时间后检测溶血活性。[结果]研究发现,无论与溶血素同时给药或是在溶血素染毒之前给药,亦或是与溶血素预先单独作用一段时间后再给药,牛角地黄汤煎剂均能抑制α-溶血素致兔红细胞破裂的溶血作用。同时还发现,方剂中的赤芍和丹皮水煎液对溶血素破坏兔红细胞致溶血的活性抑制作用最为明显,是牛角地黄汤中起主要抗溶血作用的中药组分。而牛角和地黄的水煎液在各试验条件下均未表现出抑制溶血素溶血的作用。[结论]本研究表明,牛角地黄汤具有显著的对抗溶血素诱导红细胞溶血的作用,方中起主要作用的成分是赤芍和丹皮,钩藤的这种作用则比较弱,而牛角和地黄则不是牛角地黄汤中抗溶血作用的主要成分。

可控细胞膜孔形成蛋白基因的克隆与表达

根据Wood 4 6株金黄色葡萄球菌α溶血素 (α HL)基因序列设计了引物 ,用高保真PCR从 180 0株金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出了 0 .9kb的α HL基因 ,序列测定结果显示 ,两菌株α HL基因的核苷酸序列有 6个碱基差异 ,但仅引起 1个氨基酸替换。用PCR分段克隆和定点突变技术将大肠埃希氏菌外膜蛋白A信号肽序列与α HL编码区融合 ,并将其第 130～ 134位氨基酸替换为 5个连续的组氨酸 ,获得的融合基因命名为H5基因。将其克隆入 pET 30a质粒 ,用获得的重组质粒pET H5转化感受态大肠埃希氏菌 ,获得分泌性表达H5的重组菌。经IPTG诱导后 ,重组菌表达出分子质量为 35ku的H5蛋白。经镍柱亲和层析纯化的H5对兔红细胞的半数溶血值为 180ng/mL ,能使鼠成纤维细胞PA317获得对台盼蓝和海藻糖的通透性 ,且能被Zn2 + 抑制。提示 ,表达的H5蛋白为可控细胞膜孔形成蛋白 。

牛源抗金黄色葡萄球菌α溶血素单链抗体研制

由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎给养殖业造成了严重损失,抗生素是治疗奶牛乳腺炎的首选方法,但易出现耐药菌株。而目前针对金黄色葡萄球菌的疫苗也不能对奶牛乳腺炎提供足够的保护,疫苗的主要作用机理是激发机体产生抗体,故被动免疫针对金黄色葡萄球菌毒力因子的抗体也许能对感染起到一定的治疗作用。本研究首先扩增得到影响其致病性的重要毒力因子-α溶血素(Hla)的编码基因,然后将其转化到E.coli中进行表达并纯化,再以此纯化产物为抗原,从牛源噬菌体单链抗体表达文库中筛选到了一株针对α溶血素(Hla)高亲和力的scFv,最终将该scFv进行纯化。本研究一方面为治疗金黄色葡萄球菌所致奶牛乳腺炎提供一种新思路,另一方面也为分子水平上研究α溶血素的致病机制提供了有效的阻断分子。

这个杀手不太冷——α-溶血素在基因测序技术中的应用

这是一个虚拟的科幻故事,主要讲述了虚构人物K教授在机缘巧合之下发现金黄色葡萄球菌α-溶血素能够被用作纳米孔的故事。K教授在思考基因测序方法的时候,因梦到金黄色葡萄球菌(又称金葡菌)攻击红细胞而受到启发,最后思考出了纳米孔测序的方法。

牛源金黄色葡萄球菌α溶血素单链抗体对小鼠乳腺的保护作用

为探究治疗奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂,研究将前期获得的特异性针对金黄色葡萄球菌毒力因子α溶血素的单链抗体scFvZZ107,在小鼠感染金黄色葡萄球菌乳腺炎模型中验证其保护作用。结果显示,3种不同剂量(5、10、15μg)单链抗体处理组乳腺组织内细菌数量分别为25.42±1.3、3.33±0.53和4.8±0.78 lgcfu/mg,IL-1α的含量分别为49±7.91、31.37±2.26和57.34±4.48 pg/mL,IL-1β含量分别为40.91±7.39、47.81±4.78和39.2±2.28 pg/mL,IL-8的含量分别为48.64±1.86、41.65±3.07和45.74±1.56 pg/mL,与生理盐水处理组相比,单链抗体中、高剂量处理组乳腺内金黄色葡萄球菌检出量显著减少(P<0.05),且IL-1α、IL-1β与IL-8的含量均显著降低(P<0.05)。通过观察小鼠乳腺组织HE和TUNEL染色情况,与生理盐水处理组相比,scFv中、高剂量处理组乳腺组织更加完整,凋亡细胞的数量也更少,表明scFvZZ107对小鼠乳腺具有良好的保护作用。

纳米通道技术及应用

纳米通道技术是近年来发展的一种直接解读核酸分子编码信息的新方法 ,它通过将单链核酸上的核苷酸序列直接转化为电信号 ,能以每秒超过 10 0 0个碱基的速度对其进行超快速序列分析 ,较现有测序方法更简便快速和省钱 .该技术除可用于核酸超快速外 ,还在病原体基因诊断、单核苷酸多态性和样品多成分的快速检测等多个领域有重要用途 .

食源性金黄色葡萄球菌溶血素基因的多重PCR检测和聚类分析

目的建立多重PCR方法检测金黄色葡萄球菌α-溶血素、β-溶血素、h-溶血素基因以及16S rDNA,了解食源性金黄色葡萄球菌中3种溶血素基因的分布情况和溶血表型,并对菌株进行聚类分析。方法建立多重PCR方法检测148株食源性金黄色葡萄球菌的hla、hlb和hemolysin基因,并研究其分布情况,同时用血平板法检验其溶血表型,对数据进行汇总分析。结果148株菌中131株检出hla基因(88.51%),90株菌检出hlb基因(60.81%),28株菌检出hemolysin基因(18.92%);表型溶血的有131株(88.51%),不溶血的有17株(11.49%);以溶血素基因型和溶血表型为聚类因素,将148株菌以100%相似度为界分为A～L共12个型,其中以A型为主,有58株(39.19%),B型37株(25.00%),C型18株(12.16%)。结论该四重PCR方法特异性高,快速简便,能满足高通量菌株筛选的要求;食源性金黄色葡萄球菌普遍携带hla基因,聚类分析以A型和B型为主。

金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备

目的利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌(SAU)重要的外分泌毒力因子α-溶血素(alpha hemolysin,Hla),检测Hla蛋白对不同种属红细胞的裂解作用;制备其特异性抗体,并检测抗体的中和活性。方法以SAU NCTC-8325菌株基因组为模板,PCR扩增hla基因,构建重组表达载体p ET-28a-Hla,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达,通过Ni2+柱亲和纯化获得Hla蛋白;通过红细胞裂解实验测定Hla蛋白的溶血活性。结果重组Hla蛋白以可溶形式表达,细胞裂解实验表明,纯化的Hla蛋白可以显著裂解兔红细胞,但人红细胞和羊红细胞对Hla杀伤作用不敏感。ELISA结果表明,获得了效价较高的多克隆抗体。该抗体可以有效抑制Hla对兔红细胞的裂解作用。结论 SAU的Hla蛋白对不同种属红细胞的溶解能力不同,为探讨Hla裂解细胞的机制给予一定的提示;同时所制备的特异性抗体(anti-Hla)可以抑制Hla的溶血作用,为深入研究Hla的致病机制奠定了基础。