RP-HPLC法测定鹅膏菌中毒患者体液中的α-amanitin

建立了反相高效液相色谱法检测蘑菇中毒患者体液中的αamanitin及其含量的方法,使用填料为YEGC18,10μm的反相柱,10%的乙腈+90%0.02mol/L的醋酸铵和24%的乙腈+76%0.02mol/L的醋酸铵为流动相,冰醋酸pH5.0,检测波长295nm,流速为1mL/min,柱温40℃,样品用无水甲醇提取;结果表明αamanitin进样在0.01～0.1μg的范围内与峰面积呈良好线性关系,相关系数r为0.9958,回收率为97.9%.

致命鹅膏不同生长时期α-amanitin毒素的含量变化

采用高效液相色谱(HPLC)技术对我国剧毒蘑菇新种——致命鹅膏AmanitaexitialisZhuL.Yang&T.H.Li子实体不同生长时期的主要鹅膏毒素α-amanitin(α-鹅膏毒肽)的含量进行了分析。结果表明:致命鹅膏在不同的生长阶段,其α-amanitin的含量有较明显变化:成熟老化时期的子实体α-amanitin的含量最低,仅为1462.7μg/g干重;含量最高的是生长旺盛时期的子实体,达2226.8μg/g干重,比成熟老化期的多34%;菇蕾时期的含量处于前两者之间,为1725.9μg/g干重,比成熟老化期的多15%,但比生长旺盛期的少22%。这表明致命鹅膏在子实体生长过程中,其α-amanitin的含量可能呈正态分布变化。

环肽α-amanitin在小鼠体内的毒性作用研究

目的研究环肽α-amanitin在动物体内的毒性作用。方法对小鼠尾静脉和腹腔注射给药,确定环肽α-amanitin对小鼠的半数致死量(LD50);研究α-amanitin对小鼠外周血血象和生化指标的影响,脏器指数、组织病理学改变,并定性检测中毒小鼠血液及组织中的α-amanitin。结果腹腔和尾静脉两种给药方式的LD50分别为0.742mg/kg和0.327mg/kg。对小鼠尾静脉注射0.327mg/kgα-amanitin24h后,小鼠白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血红蛋白(Hb)明显降低,同时尿素氮(BUN)和肌酐(Crea)明显增高,谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素和结合胆红素(ALT、AST、TBIL和DBIL)值分别增高至空白对照组的24.0、9.6、26.3和37.0倍;作用48h后,小鼠肝脏和肾脏指数显著增高,细胞核碎裂和组织局灶性坏死,肝脏和肾脏组织中可检出α-amanitin。结论小鼠对α-amanitin毒性作用的敏感血液指标是BUN、Crea、ALT、AST、TBIL和DBIL;肝脏、肾脏是主要受损脏器,α-amanitin作用后期,可以蓄积在肝脏和肾脏。

环肽a-amanitin对人肝癌细胞SMMC-7721的体外毒性作用研究

目的研究毒蕈环肽a-amanitin对人肝癌细胞SMMC-7721的体外毒性作用。方法运用MTT法研究α-aman-itin不同浓度和不同作用时间对体外传代培养的人肝癌细胞SMMC-7721的抑制增殖作用,再进行环肽α-amanitin对细胞毒性作用的数学模型拟合。结果研究发现,α-amanitin的使用剂量与细胞存活率存在负相关。7.12×10-4mmol/L和7.12×10-10mmol/Lα-amanitin对SMMC-7721作用24 h后,细胞存活率分别为71.25%和87.47%,作用效果分别与10 mmol/L和2.5 mmol/L环磷酰胺相似。SMMC-7721细胞存活率平方根的反正弦值与α-amanitin浓度的对数变换值的相关和回归分析结果显示二者显著性相关,曲线拟合结果显示三次曲线模型拟合最好,回归方程为Y=31.257 7-12.902X-1.5117X2-0.0616X3。对SMMC-7721细胞存活率平方根的反正弦值与α-amanitin作用时间进行相关和回归分析,二者显著性相关,三次曲线模型拟合最好,对应回归方程为Y=89.668 5-8.616 6X+1.791X2-0.1271X3。结论环肽a-amanitin对人肝癌细胞SMMC-7721体外增殖有显著抑制作用,且单位摩尔数的α-amanitin抑制作用远强于单位摩尔数的环磷酰胺。

α-amanitin线性肽骨架融合基因表达条件的优化

利用加端PCR技术在 pGEX 1λT质粒BamHI和PstI位点间 (片段BamHI端 )加入α amanitin线性八肽碳骨架编码序列 ,再将两次连续加端PCR产物连入BamHI、PstI双酶切的pGEX 1λT载体 ,得到含α amanitin线性碳骨架编码序列的阳性重组子pGAT 1 .序列测定和结果分析显示 ,构建的融合基因相位正确 ,阅读框通读 .通过对融合基因在大肠杆菌中表达条件的优化 ,目的融合蛋白的表达量可提高 33.5 %,占总蛋白表达量的 2 8.3%.

α-鹅膏蕈碱在大鼠体内的毒代动力学与组织分布特征

目的研究α-鹅膏蕈碱在大鼠体内的毒代动力学和组织分布特征。方法SD大鼠ip给予α-鹅膏蕈碱(1.5 mg·kg^(-1)),于给药前和给药后5,10,20,30和45 min及1,1.5,2.5,4和8 h分别采集尾静脉血,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定血液中α-鹅膏蕈碱的浓度,应用DAS 2.0药动学软件,以非房室模型法计算统计矩参数,绘制浓度-时间曲线,拟合毒代动力学参数。依据毒代动力学结果,将18只SD大鼠随机分为3组,分别于给药15和40 min及2.5 h后处死,采集心、肝、脾、肺、肾、全脑、小肠、胃壁和睾丸9种组织样本及左心室动脉血,LC-MS/MS法测定α-鹅膏蕈碱浓度。结果大鼠ip给予α-鹅膏蕈碱后,全血峰浓度(C_(max))为(633±121)μg·L^(-1),消除半衰期(T1/2)为(0.72±0.37)h,达峰时间(T_(max))为(0.52±0.16)h,体内总清除率(CLz)为(1.62±0.26)L·h·kg^(-1),曲线下面积(AUC_(0-t))为(946±183)μg·h·L^(-1),平均滞留时间(MRT0-t)为(1.18±0.17)h,表观分布容积(Vz)为(1.65±0.86)L·kg^(-1)。组织分布研究结果表明,α-鹅膏蕈碱在SD大鼠体内广泛分布,肾中浓度最高,其次是肺、小肠、胃壁、左心室动脉血和肝,心、脾和睾丸等中含量较低,脑中含量极低。α-鹅膏蕈碱吸收消除快,在各组织中15 min即可检出,40 min达峰,2.5 h后浓度低于15 min。结论ip给予α-鹅膏蕈碱在SD大鼠体内吸收消除快,给药后约0.52 h血药浓度达峰值,4 h后不能检出;α-鹅膏蕈碱主要分布在肾,其次为血流丰富的组织及代谢器官,如肺、小肠、胃壁、左心室动脉血和肝等,在心、脾和睾丸等组织含量较低,脑组织含量极低。推测其血脑屏障透过率低,对肾可能具有毒性靶向作用。

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法快速检测菌类中鹅膏毒肽毒素

采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定蘑菇中3种鹅膏肽类毒素的含量[α-鹅膏毒肽(α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-AMA)和γ-鹅膏毒肽(γ-AMA)]。将样品均质后,利用甲酸-甲醇-水(0.5∶10∶89.5,v/v/v)标准混合溶液提取,经由BEH shield RP18柱(150 mm×2.1 mm,1.7μm)实施分离,采取梯度洗脱,流动相为0.03%氨水与甲醇,在HESI离子化方式下以tSIM正离子模式进行扫描检测,外标法定量。蘑菇所含3类鹅膏肽类毒素具良好线性关系,区间是0.05 mg/kg~5 mg/kg,相关系数r均在0.995以上,确定α-AMA、γ-AMA检出限是0.01 mg/kg,定量限是0.02 mg/kg;β-AMA的检出限和定量限分别为0.02 mg/kg和0.05 mg/kg。平均回收率于3个加标水平下处在72.5%~91.9%范围,相对标准偏差(RSD,n=6)为2.8%~7.4%。方法简单高效,适用于蘑菇中3种鹅膏肽类毒素(α-AMA、β-AMA和γ-AMA)的快速检测。

毒蕈中α-鹅膏毒肽的中毒机制及检测技术研究进展

α-鹅膏毒肽是毒蕈中分布广、含量高且毒性极强的蘑菇毒素,其性质十分稳定,一般的加热烹饪方式难以使之失活,误食含有该毒肽的毒蕈可引发中毒效应,具体表现为呕吐、腹泻等严重胃肠道反应甚至可导致肝肾功能衰竭,其发病迅速且目前没有特效药可以解毒,对食品安全和人类的生命健康安全造成了极大的威胁。传统的检测方法存在设备不便携、成本昂贵、检测速度慢等弊端,因此,通过了解α-鹅膏毒肽的致毒机制和建立准确、高效、便捷的检测技术对于有效防范α-鹅膏毒肽中毒事件的发生意义重大。本文简要综述了α-鹅膏毒肽的中毒症状、中毒机制、现有的解毒方式,着重阐述了α-鹅膏毒肽的检测技术研究进展,并对未来快速免疫检测技术的发展进行了展望,以期为治疗α-鹅膏毒肽中毒和保障人类的生命健康安全提供有效的帮助。

高效液相色谱⁃串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素

蘑菇毒素种类繁多,化学结构差异大,为了实现蘑菇中毒素的准确、高通量分析,本文采用固相萃取净化技术,以高效液相色谱⁃串联质谱法(HPLC⁃MS/MS)为分析手段,建立了蘑菇中5种鹅膏肽类、2种色胺类蘑菇毒素的分析方法。优化了色谱条件、质谱参数和样品提取净化方法,蘑菇干粉以含0.3%甲酸的甲醇提取,强阳离子交换柱(SCX)净化后,待测样液用T3色谱柱分离,以含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液、乙腈为流动相进行梯度洗脱,采用多反应监测模式(MRM)扫描,以基质匹配标准曲线法对鹅膏肽毒素定量,以同位素内标法对色胺类毒素定量。结果显示,7种毒素在一定的浓度范围内与峰面积(或峰面积比)均呈良好的线性关系(r^(2)>0.99)。蟾蜍色胺、脱磷裸盖菇素、鹅膏肽类毒素的检出限(LOD)分别为2.0、5.0、10μg/kg,定量限(LOQ)分别为5.0、10、20μg/kg;以香菇干粉为基质,在3个水平下加标,5种鹅膏肽类毒素的回收率为71.8%~115%,相对标准偏差(RSD)为2.14%~9.92%;2种色胺类毒素的回收率为80.6%~117%,RSD为1.73%~5.98%;与国家市场监管总局食品补充检验方法BJS 202008进行比对,结果表明鹅膏毒素含量具有可比性,无显著性差异(p>0.05)。该方法简便、快速,准确度和精密度较高,符合要求,适用于野生蘑菇中7种蘑菇毒素的检测。采用该法开展了福建省野生蘑菇中蘑菇毒素分布情况的调查,在全省9个设区市采集了59份野生蘑菇样品,采用核糖体DNA内转录间隔区(rDNA⁃ITS)分子条形码技术进行了种属鉴定,在2份样品中检测出了蘑菇毒素,在1份拟灰花纹鹅膏(Amanita fuligine⁃oides)干粉提取物中检出α⁃鹅膏毒肽、β⁃鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽,含量分别为607、377、69.0 mg/kg;在1份口蘑科(Tricholomataceae)蘑菇中检出脱磷裸盖菇素,含量为12.6 mg/kg。

正电性金纳米-核酸适配体纳米生物传感器快速检测野生菌中的α-鹅膏毒肽

目的 构建一种基于正电性金纳米-核酸适配体的纳米生物传感器,以实现野生菌中α-鹅膏毒肽(α-amanitin, α-AMA)的快速检测。方法 选择可与α-AMA特异性结合的核酸适配体作为识别元件,以半胱氨酸(cysteamine, Cys)修饰的正电性纳米金(gold nanoparticles, AuNPs)作为信号探针。基于静电吸附作用,将适配体固载到Cys@AuNPs表面。测定溶液在特定波长处吸光度值的变化,实现α-AMA的快速检测。结果 该纳米生物传感器检测α-AMA的最佳条件:Cys@AuNPs体积为150μL,适配体浓度为6 nmol/L, Cys@AuNPs与适配体反应时间为10min, α-AMA与适配体结合时间为10 min。在最佳条件下检测α-AMA的线性范围为1~125 ng/mL(r2=0.995)。本体系中α-AMA的检出限为0.87 ng/mL,加标回收率为98.6%~120.0%。结论 该纳米生物传感器操作简便、灵敏度高、特异性好、成本低廉,适用于野生菌样品中α-AMA的快速检测。

鹅膏毒肽中毒动物模型建立的研究进展

蘑菇中毒是我国最严重的食品安全问题之一。90%以上蘑菇中毒致人死亡事件是因误食含鹅膏毒肽的蘑菇。目前,关于鹅膏毒肽毒理机制、毒代动力及中毒治疗研究众多,但缺乏不同目的动物模型建立的综述。因此,本文根据实验目的及内容对动物选用、毒药物类型、注射方式及剂量等多方面进行综述,旨在为建立鹅膏毒肽中毒动物模型提供理论依据和参考。

α-鹅膏毒肽对2.2.15细胞乙肝病毒HBsAg和HBeAg分泌的影响

目的观察α-鹅膏毒肽(α-Amanitin)对HepG22.2.15细胞(2.2.15细胞)乙肝病毒(HBV)HBsAg和HBeAg分泌的影响。方法用不同浓度的α-鹅膏毒肽作用2.2.15细胞,用MTT法检测细胞毒性,时间分辨免疫荧光法(TRFIA)测定上清HBsAg和HBeAg浓度。结果α-鹅膏毒肽在0.006～0.800μg/mL时,对HepG22.2.15细胞无明显毒性作用,当浓度达到4.000～20.000μg/mL时毒性较明显,TC50为10.190μg/mL;其对上清液HBsAg和HBeAg的抑制随浓度的增加而加强,其半数抑制浓度分别为0.495μg/mL和0.346μg/mL。结论在无毒或低毒浓度下α-Amanitin能抑制2.2.15细胞株HBsAg和HBeAg的分泌,可能与α-Amanitin抑制HBVDNA的复制有关。

鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞的毒性作用研究

目的比较不同浓度的鹅膏蕈碱(α-amanitin)对C6胶质瘤细胞毒性作用。方法采用体外培养方法。结果C6胶质瘤细胞在不同浓度的鹅膏蕈碱分别作用12和24 h后呈无规律改变;但48 h后,随着浓度的增强,C6胶质瘤细胞的增殖能力越来越差,细胞坏死也随之增多。结论鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞作用一定的时间后,对C6胶质瘤细胞的抑制作用随浓度的增加而增加,呈浓度依赖性。

超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱指纹图谱检测毒蕈中4种鹅膏肽类毒素

建立了基于超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC-ESI-Q-TOF)的4种鹅膏肽类毒素特征信息的色谱和质谱指纹图谱和分析鉴定方法。样品用含0.1%TFA的甲醇溶液提取后,再用Oasis HLB固相柱净化,洗脱液经UPLC HSS T3色谱柱分离后,采用ESI-TOF MS和ESI-Q-TOF MS2进行测定;建立了包含毒素准分子离子准确质量数及其同位素特征,以及二级质谱特征子离子信息的指纹图谱;方法定量测定的线性范围在50～1000μg/L,相关系数在0.9974～0.9985之间;4种毒素的检出限均为10μg/L;定量限为50μg/L;加标回收率在68.2%～88.2%之间;相对标准偏差为7.2%～11.8%。对采集的20余种野生菌样品进行分析,有5种样品检测出含有毒素。本方法快速、准确、选择性好、特异性强,适用于突发毒蕈中毒事件样品中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽的确证分析。

鹅膏菌毒素的研究进展

鹅膏菌的主要毒素根据其结构、性质等可分为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽和毒伞素3类。通过对毒肽进行定向修饰,可以改造它们的化学性质和生物学特性。随着对它们的深入了解和研究,这3类毒肽已经成为具有广阔研究和应用前景的新兴资源。为进一步认识和利用这些资源,本文对鹅膏菌毒素的分布、检测、化学结构、化学性质、代谢动力学、毒理,临床症状与治疗,以及综合利用等方面的研究进展作了系统的总结和评述。

长白山鹅膏菌肽类毒素的HPLC分析

采用HPLC法对长白山地区分布的10种鹅膏菌中的-鹅膏毒肽(-amanitin)、鹅膏毒肽(-amanitin)和鬼笔毒肽(phalloidin)3种毒素的含量进行了测定。结果表明:白鹅膏(A.verna)和鳞柄白鹅膏(A.virsa)中含有-amanitin和-amanitin两种毒素,二者-amanitin的含量分别为 1861.85g/g和2477.02g/g,均高于欧洲产毒鹅膏(A.phalloides)中的含量(1607g/g)而接近灰花纹鹅膏Amanita fuliginea中的量(2633.80g/g)。毒鹅膏A.phalloides中含有3种毒素,并且菌蕾中的含量高于成熟子实体,尤其菌蕾中Phalloidin的含量(1113.35g/g)是灰花纹鹅膏成熟子实体中(432.5g/g)的3倍。

鹅膏菌毒素及其毒理研究进展

鹅膏菌是一类真菌的总称 ,误食野生蘑菇的中毒事件中 ,95%以上由鹅膏菌引起。国外自六十年代起 ,对其毒素毒理进行了深入的研究 ,而国内则只是在九十年代才刚开始这方面的工作。为促进国内鹅膏菌毒素毒理的研究 ,作者概括了国内外各方面的资料 ,写就本文。本文概述了鹅膏菌多肽毒素的种类、鹅膏菌毒素中毒反应及病理学症状、机体对鹅膏菌毒素的吸收、鹅膏菌毒素的毒性和毒理以及鹅膏菌毒素在生命科学研究中的应用 ,为国内这方面的研究提供了参考。

7种鹅膏菌属真菌肽类毒素的HPLC分析(英文)

利用HPLC法对长白山地区分布的7种鹅膏属真菌成熟子实体中的α鹅膏毒肽(αamanitin)、β鹅膏毒肽(βamanitin)和鬼笔毒肽(phalloidin)的含量进行了测定。结果表明:芥橙黄鹅膏(Amanitasubjunquillea)和橙黄鹅膏(Amanitaaff.citrina)中均含有3种毒素,其中芥橙黄鹅膏的α鹅膏毒肽含量为2395.91μg/g、β鹅膏毒肽含量为1653.75μg/g和鬼笔毒肽含量为405.26μg/g;橙黄鹅膏的分别为1121μg/g、4244μg/g和9442μg/g。芥橙黄鹅膏白色变种(Amanitasubjunquilleavar.abla)中含有β鹅膏毒肽,其含量为614.00μg/g。其他5种鹅膏中均未检测到上述3种毒素。

在线液相色谱-二极管阵列检测器-串联质谱法检测野生菌中鹅膏毒肽和鬼笔毒肽

建立了在线液相色谱-二极管阵列检测器-串联质谱技术(LC-DAD-MS/MS)同时测定野生菌中多肽类蘑菇毒素(鹅膏毒肽和鬼笔毒肽)的分析方法。样品经甲醇提取,水稀释后,在碱性条件下用XBridge^(TM) BEH C_(18)柱(150m m×3.0 m m,2.5μm)分离,并先后用DAD和MS/MS检测。使用碱性流动相能够实现5种多肽类蘑菇毒素在15 m in内达到基线分离,同时又能有效抑制质谱加钠峰[M+Na]^+的响应信号,保证检测的稳定性和灵敏度。5种蘑菇毒素在0.05~500 mg/kg范围内线性关系良好,相关系数(r)>0.99;检出限为0.005~0.02 mg/kg。通过实际样品检测,证明该法操作简单、快速,灵敏度高,宽的定量检测线性范围能满足实际样品中蘑菇毒素含量变化大的特点。

在线固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测蘑菇中毒患者尿液中痕量α-鹅膏毒肽

建立了在线固相萃取-液相色谱-串联质谱(online SPE-LC-MS/MS)测定蘑菇中毒患者尿液中痕量α-鹅膏毒肽的分析方法。样品经甲酸酸化的乙腈-甲醇(5∶1,v/v)沉淀蛋白质,反相液液微萃取去除样品提取液中的有机溶剂,毒素经ODS微柱(5 mm×2.1 mm,5μm)在线SPE净化,XBridgeTM BEH C18色谱柱(150 mm×3.0 mm,2.5μm)分离,MS/MS测定。采用基于定量环的快速阀切换技术作为在线SPE和LC-MS/MS模块的接口,使得两个分离模块互相独立,无论是流动相还是压力,都不会互相干扰,保证了系统的稳定性;在线系统的精准净化,有效消除了后续质谱检测的基质效应,确保了尿液中痕量水平α-鹅膏毒肽的定性定量检测。尿液中α-鹅膏毒肽在0.1~50μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)为0.9983;检出限(LOD)为0.03μg/L;α-鹅膏毒肽的加标(0.1、2.0和20μg/L)平均回收率为84.3%~91.7%,相对标准偏差(RSD)为3.8%~7.2%。体内鹅膏毒肽代谢迅速,生物基质中痕量水平毒素的检测是其中毒实验室鉴定的主要难题,通过实际样品检测,证明该法操作简单,准确、灵敏;溶剂沉淀蛋白质和反相液液微萃取去除有机相和脂溶性基质的简单操作,可以作为水溶性毒素在线SPE-LC-MS/MS检测时快速且有效的配套前处理方法;基于在线SPE精准净化技术,可以实现尿液中α-鹅膏毒肽的高灵敏度测定(LOD为0.03μg/L),解决了中毒时患者体内痕量水平α-鹅膏毒肽定性确证的难题,部分患者α-鹅膏毒肽中毒实验室鉴定的时间可以扩展到90 h以上;同时,痕量水平的定量检测技术,可以为中毒后迅速代谢的α-鹅膏毒肽在体内的剂量反应关系研究提供可靠的技术支撑。