杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amas-tin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin,并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3.1(+)中,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。以pcDNA3.1-amastin转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3.1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果:在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-amastin成功地转入NIH3T3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后,用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因,表明获得了稳定表达。结论:成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒,并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。

硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆与序列分析

[目的 ]克隆硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白 (amastin)的编码基因序列。 [方法 ]应用核苷酸序列数据库 (GenBank)和表达序列末端片段数据库 (dbEST)的计算机检索与DNA文库的杂交筛选方法。 [结果 ]从dbEST数据库中获得一段 30 9nt的来源于硕大利什曼原虫的基因片段 ,据此设计探针 ,筛选硕大利什曼原虫的DNA文库 ,获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因。其开放读码框架由 5 5 2个核苷酸组成 ,编码产物由183个氨基酸残基组成。序列分析表明 ,硕大利什曼原虫与锥虫无鞭毛体蛋白一级结构的同源性为 2 3 5 %。 [结论 ]克隆的基因系硕大利什曼原虫表面蛋白编码基因 ,即无鞭毛体蛋白的编码基因。

墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的克隆墨西哥利什曼原虫（L．mex）WR972株的无鞭毛体蛋白（amastin）的编码基因，并对其同源核苷酸序列进行分析。方法根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列，设计并合成无鞭毛体蛋白基因特异性引物，以墨西哥利什曼原虫WR972株的基因组DNA作为模板，进行多聚酶链反应（PCR）扩增。将扩增的DNA片段克隆到pCR2．1T载体中，进行测序，并对同源的核苷酸序列分析、比较。结果从体外培养的墨西哥利什曼原虫WR972株提取基因组DNA，以无鞭毛体蛋白基因特异性引物进行PCR扩增获得550bp的DNA片段。克隆到pCE2．1T载体片段进行的序列测定结果表明，获得了墨西哥利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因片段，与亚马逊利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因之间具有高度的同源性。结论实现了墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化，为进一步研究其表达及作为疫苗研究的候选基因奠定了基础。

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因。方法PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L．d．SC10H2与四川南坪犬株L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入pcDNA3．1(+),构建真核表达重组质牲,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达,结果2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因。同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。结论获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L．d．SC10H2和L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达。

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒的构建

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的原核表达重组质粒pET-amastin。方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-amastin。结果:扩增出大小约550 bp的无鞭毛体蛋白基因,重组质粒pET-amastin经鉴定正确。结论:成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒pET-amastin。

亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化与序列分析

目的 克隆亚马逊利什曼原虫 (L.ama)无鞭毛体蛋白 (am astin)的编码基因 ,并对其同源基因序列进行分析。方法 根据我们首次克隆的硕大利什曼原虫 (L.m ajor)无鞭毛体蛋白的编码基因 ,设计并合成核苷酸序列特异性引物 ,以亚马逊利什曼原虫基因组 DNA为模板 ,以多聚酶链反应 (PCR)技术扩增无鞭毛体蛋白的编码基因 DNA片段 ,并进行核苷酸序列测定以及核苷酸序列的同源性分析。结果 克隆了亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因 ,含有单一开放读框 ,长度为 5 5 2 bp,编码的无鞭毛体蛋白由 183个氨基酸残基 (aa)组成。亚马逊利什曼原虫与硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因之间高度同源 ,在核苷酸与氨基酸残基序列水平上的同源性分别为 96 %和 94%。

Cloning and sequence analysis of an a mastin coding gene from Leish maniamajor Abdou

Objective To clone a surface protein encoding gene from Leishmania major Abdou parasites Methods Using Trypanosotidae cruzi (T cruzi) amastin DNA sequence as a reference, computer search was done on Genbank and dbEST data bases with BLASTN path A Leishmania major Abdou DNA library has been established and screened by in situ colony hybridization Results No homology sequence to T cruzi amastin was found in Genbank, but a 309?nt DNA fragment from Leishmania major (L major) existed in bEST Leishmania major Abdou DNA library was screened using specific probes synthesized according to 309?nt DNA sequence of T cruzi amastin gene, and full length coding sequence for Leishmania major Abdou amastin was cloned The coding sequence consisted of 552?nt, and translated into 183 amino acid residues The homology is 23 5% at amino acid sequence level between Leishmania major Abdou and T cruzi amastins Conclusion We have cloned the full length amastin coding DNA for Leishmania major Abdou

利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的 克隆 4株利什曼原虫表面无鞭毛体蛋白 (amastin)的编码基因 ,并进行序列分析。方法 根据锥虫 (T .cruzi)与利什曼原虫亲缘关系相近的原则 ,首先以锥虫无鞭毛体蛋白的基因为参考 ,对GenBank中的dbEST数据库检索 ,获得硕大利什曼原虫 (L .major)一段 30 9核苷酸片段 ,根据其序列合成探针 ,对硕大利什曼原虫基因组DNA文库筛选 ,首先获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因 ,再以硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因序列为依据 ,合成特异性引物 ,以多聚酶链反应 (PCR)扩增获得亚马逊利什曼原虫 (L .ama .)、巴西利什曼原虫 (L .bra .)和墨西哥利什曼原虫(L .mex .)的无鞭毛体蛋白基因。结果 克隆了 4株利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码的基因。均为国际上首次克隆化基因 ,已被美国GenBank收录。结论 实现了

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白N端胞外区基因(ast1)的克隆及表达

构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白N端胞外区基因(ast1)的原核表达重组质粒pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21中进行表达。从杜氏利什曼原虫基因组DNA中扩增无鞭毛体蛋白基因并用SOSUI和Tmpred方法预测其跨膜区结构;根据跨膜区预测的结果,扩增基因ast1并将其连接到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒命名为pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和免疫印迹分析表明,在约27kDa处获得重组目的蛋白rAST1的表达,显示成功构建杜氏利什曼原虫原核表达重组质粒pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21中获得有效表达。