mRNA差异显示技术的应用与改进

目的 :克隆和研究高低分化胆管癌间差异表达基因。方法 :对mRNA差异显示PCR(DDRT PCR)的一系列条件进行了探索和改进 ,建立了有效的DDRT PCR法。结果 :在高、低分化胆管癌差异分化基因的研究方面获得了满意的结果 ,共获得 9个有显著差异的cDNA片段 ,测序后进行同源序列比较 ,有一个与层粘连蛋白受体基因高度同源 ,还有一个可能是一个新基因的部分序列。结论 :通过对传统方法的改进 ,大大提高了工作效率 ,降低了实验成本和工作量并对相关问题进行了探讨 ,为进一步的研究奠定了基础。

mRNA差异显示方法的建立及条件优化

目的研究大鼠皮肤肌肉特异性基因的表达,探讨引物的不同、退火温度变化与扩增产物特异性之间的关系。方法12只健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为正常对照组与实验组(挫伤4h)。分别提取总RNA,反转录成cDNA,通过不同引物、退火温度及反应体系进行PCR产物扩增,比较不同条件下差异条带的情况。结果总RNA量在2-4μg时,扩增条带最亮;提高反转录温度有利于长片段cDNA的合成;使用TaKaRa公司带有T7启动子的OligodT12NM和M13的随机引物时,可最大限度地减少非特异性条带;先使用低严谨的退火温度,再使用高严谨的退火温度可显著地增强差异条带重复性和敏感性。结论差异显示技术方法简便、灵敏、高效,适用于一般性的基因差异表达研究。

运用锚引物扩增新城疫病毒鹅源分离株基因组末端序列

在T4RNA连接酶的作用下,将人工合成的锚引物直接与新城疫病毒(NDV)鹅源毒株ZJ1株的基因组5′末端的反转录产物及NDV基因组3′末端直接相连,然后用聚合酶链反应(PCR)和RT PCR分别快速扩增基因组5′末端和3′末端。测序结果表明:3′末端的Leader序列为55nt,5′末端的trailer序列为114nt。将该序列与GenBank报道的NDV鸡源毒株的相应序列相比,ZJ1株与6个鸡源NDV毒株的Leader和trailer序列的同源性分别为83.6%～92.7%和60 5%～63.2%。序列比较结果表明:该鹅源毒株与鸡源毒株在基因组3′端调控区有较高的同源性,而在基因组5′端的调控区同源性则较低。

干旱胁迫下新疆野生沙生冰草的银染mRNA差异显示分析

运用非同位素银染mRNA差异显示方法,分析新疆野生沙生冰草抗旱基因表达差异。用10%(-1.0Mpa)PEG-6000溶液处理三叶一心期冰草,以叶片mRNA为模板采用锚定引物和随机引物组合,进行反转录差异显示PCR扩增,经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后用银染方法差异显示DNA条带,在直观下,从凝胶中回收差异带并进行再扩增,2%琼脂糖电泳得到了DNA的单一条带。通过分离与冰草抗旱性状相关的基因片段,为进一步从分子水平上认识冰草抗旱机理、进行抗旱相关基因的遗传操作奠定基础。

三疣梭子蟹微卫星标记的筛选及特征分析

微卫星序列包含有多种重复单元,在其两碱基重复的类型当中,CT/GA重复类型在功能基因组中比例较高。三疣梭子蟹是重要的养殖品种,对遗传种质的分析需要开发大量的分子标记,本文利用5’锚定引物PCT筛选三疣梭子蟹的CT/AG微卫星分子标记,测序的41个克隆子中,35条序列含有微卫星DNA序列,阳性克隆比率达到85.4%,共检测到55个微卫星位点,分布于20条序列中,其中19条序列检测到2个或2个以上微卫星位点。对所有筛选到的微卫星位点进行分类统计后表明,核心序列为(CT/AG)的有27个(50%),27个位点为其他类型的重复。结果表明三疣梭子蟹CT/AG微卫星标记在三疣梭子蟹基因组中含量较丰富,5’锚定引物法在筛选特定标记的同时,还筛选了其他类型的微卫星标记。

差异显示反转录PCR技术的建立和改进

本文对差异显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）的一系列条件进行了探索和改进，建立了有效的ＤＤＲＴ－ＰＣＲ方法。特别是单锚定碱基引物Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１２）Ｍ（Ｍ＝Ａ，Ｇ，Ｃ）的应用，不但得到了十分良好的实验结果，而且在很大程度上降低了实验成本和工作量。

刺参CT/AG微卫星标记的筛选

利用5’锚定引物PCT筛选刺参的CT/AG微卫星分子标记,测序的43个克隆子中,42条序列含有微卫星DNA序列,阳性克隆比率达到97.7%。去除重复序列后,共检测到56个微卫星位点,分布于26条序列中,其中25条序列检测到2个或2个以上微卫星位点。对所有筛选到的微卫星位点进行分类统计后表明,核心序列为(CT/AG)的有51个(91.1%),5个位点为其他类型的重复。结果表明:刺参CT/AG微卫星标记在刺参基因组中含量较丰富,5’锚定引物法在筛选特定标记的同时,还筛选了其他类型的微卫星标记,具有较强的筛选效率。

兼性无融合生殖龙须草SSR引物开发及杂交后代的检测

以来自中国5个省份12个居群的龙须草为材料,通过锚定PCR开发复合SSR引物、数据库检索和近缘物种SSR引物的引用等3种方法开发龙须草的SSR引物。结果显示:在锚定PCR开发复合SSR位点所设计的33对引物中筛选到有效扩增引物13对,表现多态性的引物有6对;利用基因特异序列法得到多态性引物3个;所用18条同源物种引物中有83%的SSR引物在供试的12个龙须草居群中都有清晰的SSR条带,其中56%的引物表现出多态性。3种方法在龙须草12个居群中共筛选得到了19对多态性引物,多态性比率约为73%。利用筛选得到的SSR多态性引物对来自2个居群的杂交F1代进行检测,鉴别出只有母本带型的无融合生殖后代和具有双亲带型的杂交后代,在子代中还出现偏父本带型、亲本缺失带型和变异带型等,证明所开发的SSR引物可以揭示龙须草生殖方式的复杂性,适用于龙须草遗传分析及亲缘关系鉴定。

锚定引物扩增多态性DNA分子标记鉴别番茄抗根结线虫病品种的研究

以抗病材料Ryau96172I和感病材料Rutagus以及所需鉴定的番茄品种为试验材料,根据Mi-1.2和Mi-1.1设计引物,利用改良SDS法提取番茄基因组DNA,用锚定引物扩增多态性DNA分子标记法标记不同番茄品种。同时利用爪哇根结线虫虫卵以5 000粒/株,接种苗龄为25 d,室内人工接种不同番茄品种。接种结果得到抗病材料2份、中抗材料2份、高感材料5份。本试验对APAPD分子标记反应体系的退火温度进行了优化,适宜退火温度为38℃。应用该体系筛选得到特异性引物1条,命名为SF30,特异片段长度为408 bp。综合以上两者结果表明,APAPD分子标记的结果与接种爪哇根结线虫鉴别番茄品种抗性结果相吻合。

聚氨酯涂料体系在石化钢结构防腐中的应用

以环氧富锌底漆、云母氧化铁中间漆、脂肪族聚氨酯面漆组成聚氨酯涂料体系,该体系具有防腐性优异、耐久性好的特点。该产品已经在石油化工装置的钢结构上得到应用,可以延长维修周期,降低运行成本。