植物基因启动子的克隆方法及其应用

植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点,启动子是基因表达调控的重要顺式元件,启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到PCR方法的应用,此后相继问世的一些基于PCR的克隆启动子技术,如载体锚定PCR、反向PCR、接头PCR、交错热不对称PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。本文着重介绍了几种植物基因启动子的克隆方法,分析了它们的优缺点,并展望了今后的研究前景。

用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异

目的 对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析 ,并为其种及种下分类提供依据。方法 采用微卫星锚定PCR(SSR PCR)及随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)对我国 6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析 ,计算遗传距离并构建进化树。结果 T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于 0 85 ;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于 0 2。河南株与前 4株的遗传距离在SSR PCR小于 0 3,在RAPD小于0 6。结论 中国 6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的 3类 :a 湖北株、天津株为一类 ;b 黑龙江株、云南株为一类 ;c 不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中。国内 6株归属于T1。此外 ,国际标准株T3。

尖吻蝮蛇未知C类凝集素蛋白cDNA扩增、克隆与表达

蛇毒中C类凝集素 (C TLs)超家族蛋白 ,是具有抗凝血等功能的一族蛋白质 .根据测得的蛇毒蛋白的N端氨基酸序列 ,设计PCR引物 ;从湖南尖吻蝮蛇毒腺中提取总RNA ,经反转录 ,再通过温度降落锚式PCR ,在只使用一个特异性引物和一个通用引物、进行一次循环数不超过 30的非巢式反应的条件下 ,即获得两个较为清晰的扩增条带 ;其中之一带经克隆、测序、比较 ,证明其与已知的蛇毒中C类凝集素超家族蛋白质有较高的同源性 .在大肠杆菌中获得高效融合表达 ,融合蛋白占细胞总蛋白的 2 6 %～ 30 %

利用5′锚定PCR技术分离枇杷微卫星标记

用5′锚定PCR技术分离出32个枇杷特异SSR位点,对其中适合设计引物的28个位点设计了相应的引物,并分别与对应的5′锚定的简并SSR引物配对,应用于5个枇杷品种的基因组PCR扩增。结果表明,27条引物在5个受试枇杷品种中有扩增产物,其中24条为可用引物,另外3条引物因为扩增产物不符合SSR标记的特征不能用作SSR标记的引物。

牙鲆变态早期cDNA文库的构建和parvalbumin基因的克隆

在前期的研究中,克隆到牙鲆变态早期和变态前差异表达的parvalbumin基因片断cDNA。为了克隆parvalbumin基因的全长cDNA,构建了变态早期(孵化后23d仔鱼)牙鲆头部的全长cDNA文库,并对文库的滴度和插入片段大小进行了评估。同时采用锚定PCR法从cDNA文库筛选出parvalbumin基因的全长cDNA。结果表明,所构建的牙鲆变态早期头部cDNA文库的滴度为1.2×106PFU·mL-1,插入片段的平均长度为1000bp左右。parvalbumin基因的全长cDNA的长度为603bp,编码109个氨基酸,含有两个EF手型钙离子结合域:DQDGSGFIEEEEL(52～64)和DSDGDGKIGVEEF(91～103),以及一个ATP/GTP结合位点模序:ACGLAGKS(33～40),是一种典型的钙离子结合蛋白。通过parvalbumin基因氨基酸序列的同源比较分析表明,牙鲆parvalbumin基因是比较保守的蛋白,与其它鱼类享有61.5%～68.8%序列同源。系统分析表明,牙鲆的parvalbumin基因与狭鳕(Theragrachalcogramma)最为接近。

单向锚定 PCR 富集扩增在克隆低丰度基因转录本中的应用

利用国际生物信息资源，通过计算机检索寻找与已知功能基因具有高度同源的ＥＳＴｓ，据此设计特异的ＰＣＲ扩增引物，并通过单侧特异引物搭配ｃＤＮＡ分子库载体引物（锚定引物），在低严紧条件下扩增各种组织的ｃＤＮＡ分子库以富集目标片段。继以单向锚定ＰＣＲ扩增产物为模板，用双侧特异引物再次扩增，获得的特异扩增ＰＣＲ产物经测序证实之后，将其用作探针杂交筛选相应的ｃＤＮＡ文库并进而克隆目的基因的全长ｃＤ－ＮＡ。此方法用于三个人类新基因的全长ｃＤＮＡ的分离与克隆，结果全部获得成功。这三个人类新基因分别是Ｈ－ＲａｌＧＤＳ基因、Ｈ－ＣＩＳ基因和Ｈ－Ｓ６ＰＫ基因，它们在ＧｅｎＢａｎｋ数据库的登录号分别是：ＡＦ０２７１６９、ＡＦ０３５９４６及ＡＦ０３７４４７。本文结果提示这一方法对于应用现有的人类基因组生物信息资源，克隆具有重要生物学功能的人类新基因，尤其是克隆呈低丰度的基因转录本全长序列具有较高的实用价值。

用锚定PCR技术筛选谷子微卫星文库的研究

本试验将锚定PCR技术用于谷子微卫星富集文库的筛选,结果发现该技术能有效减少假阳性的产生,假阳性率仅为7.7%,该技术还能够最大限度淘汰侧翼无法设计引物的无效微卫星克隆,本研究无效克隆比率仅为3.8%。用锚定PCR技术最终筛选开发出13对多态性微卫星标记,这些标记在4个谷子材料和1个野生种中扩增出等位变异数为2~4。锚定PCR技术与常用的同位素杂交筛选技术及普通PCR技术相比,更能降低假阳性克隆和无效微卫星克隆的产生,是一种理想的微卫星文库筛选技术。

微卫星锚定PCR研究湖北钉螺的遗传变异

目的 对中国不同自然隔离群的湖北钉螺进行遗传变异研究 ,并为其种及种下分类提供依据。 方法 采用微卫星锚定 PCR(SSR- PCR)技术对中国 7省 15地湖北钉螺基因组 DNA进行 PCR扩增 ,根据扩增产物 ,计算遗传距离(D) ,并构建系统进化树。 结果 各地域标本 PCR扩增产物均呈多态性 ,其中中国大陆与中国台湾湖北钉螺之间的遗传距离为 0 .35 1± 0 .0 4 8(0 .2 6 3～ 0 .4 4 5 ) ;中国大陆湖北钉螺山区型之间的遗传距离为 0 .0 4 3;湖区型之间的遗传距离为0 .0 0 0～ 0 .2 17;山区型与湖区型之间的遗传距离为 0 .182～ 0 .30 8;来自湖北省境内 9个地域的湖北钉螺 ,其遗传距离为0 .0 0 0～ 0 .16 7。 结论 根据所采集的湖北钉螺标本和 SSR- PCR的实验结果 ,认为中国大陆湖北钉螺在基因分类水平上至少可分为不同层次的 4类 :1云南洱源、四川天全为一类 ;2安徽贵池、湖南岳阳、湖北荆门、江西新建为一类 ;3湖北武汉、湖北钟祥、湖北阳新、湖北松滋、湖北沙市、湖北石首、湖北应城为一类 ;4湖北赤壁单独为一类。其中 1与 2 34在总体上可分为两大类 ,2 34又可再分为 2 3与 4两类 ,2 3还可再分为单独的两类。此外 ,台湾钉螺为单独的一类。

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因全序列RACE扩增方法的建立

为获得骆驼β-防御素基因(caBD-1 cDNA)的全长序列,采用锚定PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素基因的部分已知序列,设计了1条特异性引物作为上游引物,将反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,成功地克隆了caBD-1 cDNA的3′末端序列;采用反向嵌套PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素cDNA的部分序列,设计了1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地克隆了骆驼β-防御素caBD-1cDNA的5′末端序列。结果显示,获得了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因的全序列。证实,RACE技术用于防御素基因的扩增是可行的。

云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应体系优化研究

采用交互正交设计L64(421)对濒危植物云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应体系分别进行了5因素(Taq酶;Mg2+;dNTP;DNA及引物)4水平的优化筛选,SAS软件统计分析表明:3个单因素(Taq酶;Mg2+;dNTP)和2个交互作用(Taq×Mg2+,Mg2+×dNTP)对此反应体系有显著影响作用。云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应的优化体系是:在20μL反应体系中含有1×PCR buffer,Taq酶4 U,Mg2+(2.0 mmol.L-1),dNTP(0.4 mmol.L-1),DNA75 ng,引物(1.0μmol.L-1),退火温度(54℃)。交互正交设计既能快捷有效地筛选出最佳PCR反应体系,又能揭示试验因素及其交互作用对扩增的影响程度,分析结果更客观、准确,具有一定的应用价值。

基于锚定PCR技术对10种重要农业害虫微卫星DNA位点的筛选及其特征分析

微卫星DNA广泛存在于真核和原核生物的基因组中，具有多态性丰富、易于检测等特点，在遗传图谱的构建、动植物遗传学育种等方面被广泛应用。利用5′锚定PCR技术对桃小食心虫、桃蛀螟、玉米螟、二点委夜蛾、花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马、斑翅果蝇、稻水象甲、扶桑绵粉蚧10种重要农业害虫进行微卫星DNA筛选，并分析各个物种的微卫星DNA的特点。不同物种的阳性克隆率、微卫星比率、克隆效率和冗余率存在不同程度的差异；在核苷酸碱基数目上，主要为二核苷酸重复序列，占重复位点总数的93．2％～100％，三、四核苷酸重复位点较少。在二核苷酸重复位点中， CA/TG重复位点最为丰富，占重复位点总数的89．2％～100％。这与使用的锚定引物密切相关；10种害虫的微卫星DNA平均重复次数为6．7～8．9次，其中玉米螟具有最高的微卫星DNA重复次数（34次）；在序列类型上，完全型序列占上述害虫序列总数的91．0％～100％。5′锚定PCR技术能够快速挖掘害虫的微卫星DNA位点，本研究结果为这些害虫微卫星位点的进一步利用奠定了基础。

不同样本前处理方法对高通量测序检测HBV、HCV、TTV结果的影响

目的:探索不同样品前处理方法对于不同类型病毒检测的效果。方法:分别将携带乙肝病毒(双链环状DNA病毒)、丙肝病毒(单正链RNA病毒)、TTV(Torque teno virus)(单链环状DNA病毒)的血清等比例混合,模拟混合感染,然后分别采用多重置换扩增(MDA)和随机锚定PCR扩增并进行高通量测序,同时以原始样品(未扩增)直接高通量测序作为对照。结果:原始样品(未扩增)直接测序,产出的数据大部分为人类的序列;MDA方法中绝大部分数据为TTV、乙肝病毒;随机锚定PCR扩增方法中绝大部分数据为乙肝病毒。结论:MDA方法适合扩增环状病毒,随机锚定PCR扩增适合含量高的病毒,不做任何处理直接高通量测序检测病毒效果最差。本研究可为指导不同类型病原体如何选择扩增方案提供借鉴。

伴肌动蛋白相关锚定蛋白(N-RAP)在颈椎后纵韧带骨化中的表达及意义

目的：从蛋白质及核酸水平研究伴肌动蛋白相关锚定蛋白（N—RAP）在颈椎后纵韧带骨化中的表达．探讨其存在的临床意义。方法：选择2006～2010年间行手术治疗的20例颈椎后纵韧带骨化症患者（OPLL组）及10例因外伤行颈椎手术患者（对照组）的颈椎后纵韧带标本。所有标本福尔马林固定、石蜡包埋，以N—RAP兔抗人多克隆抗体作为I抗免疫组化SP法制片，DAB显色。选择染色满意的标本切片，观察表达N—RAP的细胞（棕黄染色）在两组样本中的数量及分布特点。5例骨化样本及5例对照样本冰浴匀浆、提取总RNA，行实时定量PCR检测。观测后纵韧带骨化症患者及对照病例后纵韧带组织中N—RAPmRNA的表达情况。结果：20例骨化韧带标本中，16例染色满意：10例对照组后纵韧带标本中，6例染色满意。免疫组化结果显示N—RAP表达于韧带组织中细胞的胞浆中，呈棕黄色染色。在OPLL组的后纵韧带组织中，可见多个黄染细胞及少量蓝色无N—RAP表达的细胞。而在对照组后纵韧带中，仅可见蓝色无N—RAP表达的细胞。实时定量PCR检测发现N—RAP在对照组标本中平均表达量为14．29±4．70，在OPLL组标本中为161．29±60．14，两组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：颈椎OPLL韧带组织中存在较高水平的N—RAP，其可能参与了韧带骨化的发生、发展过程。

红麻微卫星DNA的分离

分别采用RAPD、锚定PCR和磁珠捕获等3种方法富集含微卫星序列的红麻基因组DNA片段,并连接到pMD18-T载体,构建基因组文库.然后以通用引物M13F,M13R和根据微卫星核心序列所设计的引物[VRV(CT)12或VRV(TG)12],用PCR方法直接对文库筛选,并将获得的阳性克隆进行测序.分别从RAPD,锚定PCR和磁珠捕获3种富集方法构建的基因组文库中获得6,23,19个微卫星位点.

三种获取目的基因的PCR方法

对反向PCR、反转录PCR和锚定PCR几个常用的PCR方法的概况及其使用,做了简单介绍。

耳聋基因突变检测国家参考品的研制

目的建立耳聋基因突变检测国家参考品。方法收集健康人及含20种不同耳聋基因突变位点的志愿者血清,通过Sanger测序,从中筛选出野生型和突变型的血清样本,分装制备成一套含23份样本的候选耳聋基因突变检测国家参考品。用6个厂家8个耳聋基因突变检测试剂盒对参考品进行验证。参考品的均匀性和稳定性通过联合探针锚定聚合测序法进行检测。结果各家试剂对大部分参考品的验证结果基本一致。本实验室对参考品在验证过程中新出现的突变位点进行了测序确认。参考品的均匀性和稳定性满足要求。结论通过协作验证以及均匀性、稳定性评价,该耳聋基因突变检测国家参考品可用于耳聋基因突变检测试剂盒的质量评价。

胰岛素原转化酶基因克隆及序列测定

目的研究胰岛素抵抗和胰岛素缺乏与Ⅱ型糖尿病发病机制的关系.方法Ⅱ型糖尿病普遍存在胰岛素、胰岛素原障碍,胰岛β细胞分泌出胰岛素原经胰岛素原转化酶(Prohormone convertase,PC2)去除部分肽段后形成胰岛素.结果与结论若PC降解功能异常可导致胰岛素原及其代谢产物不适当分泌引起胰岛素缺乏,研究该基因分布和表达的变化,对探讨糖尿病胰岛素抵抗的发病机制奠定基础.

兼性无融合生殖龙须草SSR引物开发及杂交后代的检测

以来自中国5个省份12个居群的龙须草为材料,通过锚定PCR开发复合SSR引物、数据库检索和近缘物种SSR引物的引用等3种方法开发龙须草的SSR引物。结果显示:在锚定PCR开发复合SSR位点所设计的33对引物中筛选到有效扩增引物13对,表现多态性的引物有6对;利用基因特异序列法得到多态性引物3个;所用18条同源物种引物中有83%的SSR引物在供试的12个龙须草居群中都有清晰的SSR条带,其中56%的引物表现出多态性。3种方法在龙须草12个居群中共筛选得到了19对多态性引物,多态性比率约为73%。利用筛选得到的SSR多态性引物对来自2个居群的杂交F1代进行检测,鉴别出只有母本带型的无融合生殖后代和具有双亲带型的杂交后代,在子代中还出现偏父本带型、亲本缺失带型和变异带型等,证明所开发的SSR引物可以揭示龙须草生殖方式的复杂性,适用于龙须草遗传分析及亲缘关系鉴定。

SSR-PCR技术研究9种拟钉螺的遗传变异

目的对9种拟钉螺进行遗传变异研究,为拟钉螺从基因水平分类提供依据。方法采用微卫星锚定PCR（SSR-PCR）技术对海峡两岸4省7地的拟钉螺基因组DNA进行PCR扩增,根据扩增产物按Nei的方法计算遗传距离,并应用SPSS构建系统进化树。结果各地拟钉螺标本的PCR产物呈多态性,其中台湾邱氏拟钉螺与中国大陆拟钉螺地域株遗传距离为0.7391～0.9130;向氏拟钉螺和秉氏拟钉螺间扩增产物相似性最大,遗传距离为0.2174;神农架拟钉螺与向氏拟钉螺、秉氏拟钉螺的遗传距离为0.3333～0.3913;十堰拟钉螺和洪山拟钉螺之间的遗传距离为0.5556;福建拟钉螺与湖北拟钉螺地域株的遗传距离为0.3913～0.7000;武鸣拟钉螺与湖北拟钉螺地域株的遗传距离为0.6667～0.8889。结论9种拟钉螺在基因水平上至少可以分为4类：1）向氏拟钉螺、秉氏拟钉螺和神农架拟钉螺为一类;2）洪山拟钉螺和十堰拟钉螺为一类;3）武鸣拟钉螺为一类;4）福建拟钉螺为一类。台湾邱氏拟钉螺应为钉螺。

盐角草磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因(SePEAMT)启动子的克隆及瞬时表达

磷酸胆碱是合成磷脂酰胆碱和甘氨酸甜菜碱的重要前体,磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)是磷酸胆碱合成的关键酶。根据已知的SePEAMT cDNA5′端序列设计2个基因特异的反向引物(PP1,PP2),通过锚定PCR获得了PEAMT起始密码子上游1249bp的序列。RLM-RACE反应确定其转录起始位点A位于起始密码子上游301bp处,由此获得了948bp的SePEAMT启动子序列。PlantCARE和PLACE在线启动子预测工具分析表明:该序列除了含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box外,还含有一些胁迫诱导元件(如ABRE、HSE、LTR)和花粉特异的激活元件AGAAA。构建了SePEAMT启动子与报告基因GUS融合的表达载体pPro,并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,染色结果表明SePEAMT启动子可以有效地驱动GUS基因的瞬时表达。