Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡实验

课程组面向本科生开设了利用Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡的实验项目。该实验加入化疗药物依托泊苷(简称VP-16)诱导Jurkat细胞发生凋亡,使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况,在荧光显微镜下拍照计数。实验结果表明:紫外光激发下,早期凋亡细胞呈现绿色荧光,而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现红色荧光;对细胞计数可知,对照组各时期细胞数符合正常范围,经药物处理后,各时期细胞凋亡率随药物浓度升高而升高,其中早期和晚期凋亡细胞占比最高;在高浓度药物处理后,细胞被大幅度杀伤,仅剩余几个早期凋亡细胞。实验将Annexin V-FITC/PI试剂盒与荧光显微镜结合使用,突破了教学经费、规模和仪器等条件局限,实验成本相对较低,适于大班教学,实验结果直观便捷,能够让学生深入、系统地掌握细胞凋亡的实验原理和检测方法,符合本科生实验项目的综合性高、设计性强和研究性佳的特点,切实提升细胞生物学实验课程的质量和水平。

Annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较

目的比较annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的优缺点。方法用DEX诱导胸腺细胞凋亡和H2O2诱导K562细胞系细胞凋亡,应用Hoechst33342/PI和annexin V-FITC/PI双色标记流式细胞术检测体系检测细胞凋亡情况。结果 Annexin V-FITC/PI双标记法能准确地反映2种模型中的细胞凋亡情况,与其检测原理一致;而Hoechst33342/PI双标记法虽能准确反映DEX诱导胸腺细胞的凋亡情况,但在检测H2O2诱导的K562细胞凋亡时,其早期凋亡细胞的分布与其检测原理明显不符。结论与annexin-V-FITC/PI双标记法相比,Hoechst33342/PI双标记法有一定的局限性。

Annexin V-FITC/PI法检测脂多糖诱导滋养细胞的凋亡

目的:通过流式细胞术测定法检测脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对滋养细胞凋亡的影响,明确LPS与滋养细胞凋亡的关系,为预防和治疗由滋养细胞凋亡导致的病理妊娠提供新的思路。方法:利用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度的LPS处理培养的JEG-3细胞系滋养细胞的凋亡率分析。结果:流式细胞检测结果显示LPS组凋亡指数分别为(2.05±0.33)%、(7.43±0.68)%、(13.43±0.90)%显著高于对照组(0.80±0.15)%,且P均<0.01。结论:Annexin V-FITC/PI法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞;LPS能够诱导滋养细胞过度凋亡,且凋亡率随着LPS浓度的增加而增加。

Annexin V-FITC/DAPI细胞凋亡检测法

[目的]建立新的荧光染料DAPI与FITC标记Annexin V联合的细胞凋亡流式细胞术检测方法,以用于具有橙红色荧光的药物处理细胞的流式细胞术凋亡检测。[方法]以倒置荧光显微镜成像和流式细胞仪分别检测不同浓度DAPI对活和死细胞的标记作用。以荧光酶标仪检测不同浓度DAPI处理细胞的荧光信号,并进行相关性分析。以流式细胞术比较Annexin V-FITC/DAPI双染法与Annexin V-FITC/PI双染法对无色和含红/橙色荧光药物导致的细胞凋亡。[结果]DAPI标记可用于区分死细胞和活细胞,DAPI标记死细胞的荧光信号和DAPI的浓度呈线性正相关。Annexin V-FITC/DAPI双染法与Annexin V-FITC/PI双染法相比,二者对不含红橙色荧光药物诱导的多种肿瘤细胞的凋亡检测结果无显著差异。与Annexin V-FITC/PI双染法相比,Annexin V-FITC/DAPI双染法可有效避免药物自身荧光与PI通道重合导致的流式检测干扰。[结论]成功建立了新的Annexin V-FITC/DAPI双染法用于细胞凋亡的流式细胞术检测,该方法能够避免具有红、橙色荧光基团的药物对的干扰检测凋亡。

水鬼蕉生物碱对人肝癌HepG-2细胞凋亡的影响

为揭示水鬼蕉生物碱(AHL)对HepG-2细胞作用,采用FITC-Annexin V/PI双染色法检测AHL对HepG-2细胞凋亡的影响,并检测了AHL对HepG-2细胞内Ca2+浓度、活性氧(ROS)、pH的影响。结果表明:AHL可以通过细胞内ROS、Ca^2+、pH三者间相互作用而诱导细胞凋亡。

禽流感病毒NS1A蛋白诱导人肺癌细胞SPC-A1的凋亡

目的研究禽流感病毒NS1A蛋白对人肺癌细胞SPC-A1增殖的影响。方法将含有NS1A基因的重组质粒pVAX1-NS1A经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,用MTT检测其对细胞增殖的抑制作用;Annexin VFITC-PI结合流式细胞仪检测细胞凋亡率;PI结合流式细胞仪检测细胞周期的变化;对转染细胞的表达产物进行Western blot分析。结果NS1A蛋白能抑制人肺癌细胞SPC-A1增殖且呈时间依赖性。随着作用时间延长,重组质粒转染组细胞凋亡率可达38.17%,细胞周期中G0/G1比例升高,G1期阻滞。Western blot分析显示,重组质粒转染组细胞在相对分子质量约30000处可见特异性反应条带,与NS1A蛋白产物大小相符。结论禽流感病毒NS1A蛋白能够抑制SPC-A1细胞增殖,并诱导SPC-A1细胞凋亡。

食品中丙烯酰胺致小鼠睾丸生殖细胞凋亡的研究

为了解丙烯酰胺致小鼠生殖毒性的细胞凋亡机制,昆明种小鼠经丙烯酰胺(20、40、60mg/kg体重)慢性染毒8w后,应用末端转移标记技术(TUNEL)和流式细胞仪技术(Annexin-VFITC/PI)检测不同浓度丙烯酰胺对睾丸生殖细胞凋亡的影响。结果表明:两种方法检测结果均显示丙烯酰胺能引起睾丸生殖细胞的凋亡,而且随着浓度的增加细胞凋亡也逐渐增多,40、60mg/kg组的细胞凋亡率显著高于阴性对照(p<0.05),20mg/kg组的凋亡率虽然较阴性对照有所增加,但差异不显著;TUNEL法测定的细胞凋亡率高于Annexin-VFITC/PI,但两种方法测定结果无显著差异。可见,丙烯酰胺可以诱导小鼠睾丸生殖细胞发生凋亡,Annexin-VFITC/PI法及TUNEL法均能敏感检测出细胞凋亡,而且Annexin-VFITC/PI法具有更高的特异性。

黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响

目的观察黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为4组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪甲苷组和黄芪甲苷溶剂对照组。其中缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪甲苷组和黄芪甲苷溶剂对照组进行缺氧缺糖3h后再复氧复糖12 h,并于复氧复糖的同时加入黄芪甲苷。用倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活性,TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果正常对照组PC12细胞贴壁生长,呈多角形,突起明显,突起之间交织成网状,细胞膜光滑且完整,胞体折光性较强。与正常对照组相比,缺氧缺糖/复氧复糖组细胞变圆或肿胀,突起回缩或消失,细胞膜破损,胞体折光性差,细胞活性明显下降(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数明显升高(P<0.05)。与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪甲苷组细胞生长状态见好转,突起较为明显,胞体折光性较好,细胞活性升高(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数下降(P<0.05)。黄芪甲苷溶剂对照组与缺氧缺糖/复氧复糖组相比无明显差异(P>0.05)。结论黄芪甲苷可减轻缺氧缺糖/复氧复糖引起的PC12细胞损伤,提高细胞活性,抑制细胞凋亡。

茚虫威对斑马鱼的急性毒性及遗传毒性

茚虫威属噁二嗪类新型广谱高效杀虫剂,在农业生产中有着重要作用,近年来随着用量的增加,由此产生的对水生生物的影响越来越受到重视。使用斑马鱼进行茚虫威的急性毒性作用实验,并采用微核试验、彗星试验、Annexin V-FITC/PI双染色检测观察染毒后的斑马鱼是否被诱导产生遗传毒性。结果表明:在24 h、48 h、72 h、96 h,茚虫威LC50值分别为2.263mg·L-1、2.184 mg·L-1、2.184 mg·L-1、2.133 mg·L-1。茚虫威对斑马鱼急性毒性属中等毒性。96 h茚虫威浓度为1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1时,斑马鱼的微核率与对照组相比达差异极显著水平(P<0.01)。采用彗星试验检测斑马鱼肝脏DNA损伤,结果显示斑马鱼暴露于高浓度1.98 mg·L-1和2.16 mg·L-1茚虫威后,与对照组相比,斑马鱼的DNA损伤均表现为极显著差异(P<0.01)。采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪法检测,结果表明染毒后24 h斑马鱼肝细胞出现细胞凋亡现象。实验结果进一步表明,茚虫威对斑马鱼短期染毒后诱导细胞凋亡,表现出遗传毒性。

鳖甲多肽的全合成及对肝星状细胞的作用

目的研究鳖甲多肽的合成及对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的作用。方法根据鳖甲活性多肽的序列结构,采用Fmoc固相方法对多肽进行全合成,经反相高效液相色谱法分析、纯化获得合成多肽;不同浓度合成多肽作用肝星状细胞株HSC-T6 24 h,用Annexin V-FITC/PI法检测HSC凋亡。结果反相高效液相纯化后合成多肽的纯度>98.0%,经质谱鉴定其相对分子质量与理论值一致;合成多肽浓度为0.6 mg.mL-1时,早期凋亡细胞开始增多,至2.5 mg.mL-1时,坏死细胞开始增多,随合成多肽浓度增高,各组凋亡细胞随之增多。其中鳖甲合成多肽在1.2,2.5和5 mg.mL-1浓度下能显著提高HSC早期凋亡率(P<0.05)。结论鳖甲多肽可以定向合成,并且合成多肽能诱导HSC的早期凋亡。

猪繁殖与呼吸综合征病毒实验感染SPF猪外周血单核细胞和肺泡巨噬细胞早期凋亡细胞的观察

采用Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＦＩＴＣ／ＰＩ双染色法，用流式细胞仪检测了猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）实验感染ＳＰＦ猪不同时期外周血单核细胞和肺泡巨噬细胞感染Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＦＩＴＣ＋ ／ＰＩ－ 细胞群（早期凋亡细胞群）。结果显示，ＰＲＲＳＶ 感染猪外周血单核细胞和肺泡巨噬细胞Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＦＩＴＣ＋ ／ＰＩ－ 细胞群的表达率均明显高于正常对照猪（ｐ＜ ０．０１），感染后２４ｈ 表达率达最高值。结果提示，ＰＲＲＳＶ 感染早期可以诱导受感染猪单核巨噬细胞凋亡。

龙葵碱对HepG_2细胞磷脂酰丝氨酸及断裂DNA研究

研究龙葵碱对肝癌细胞HepG2的诱导凋亡作用.采用倒置显微镜观察形态学变化,Annexin V-FITC联合PI双染法和Tunel法检测龙葵碱诱导人肝癌HepG2细胞凋亡作用.结果发现龙葵碱作用24 h后,贴壁细胞数量减少、体积缩小,变圆等明显凋亡形态;在激光共聚焦显微镜下观察到AnnexinV-FITC阳性信号为绿色荧光,PI为红色荧光;Tunel阳性信号为绿色荧光.表明龙葵碱通过诱导HepG2细胞凋亡达到抗肿瘤的作用.

丹参酮ⅡA联合三氧化二砷对NB4细胞凋亡的影响

目的观察丹参酮ⅡA(Tanshinone,TanⅡA)联合三氧化二砷(ATO)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4细胞)凋亡的作用;并通过观察两药联合诱导NB4细胞凋亡时p53、Bcl-2表达的变化,探讨其可能的机制。方法通过Annexin V FITC/PI荧光染色观察1.0μg·mL-1TanⅡA分别联合0.25、0.5、1.0μmol·L-1的ATO作用于NB4细胞的形态学变化;流式细胞术Annexin V-FITC/PI法测定各组细胞凋亡率;流式细胞仪检测各组细胞p53、Bcl-2的表达。结果 (1)1.0μg·mL-1TanⅡA分别与0.5、1.0μmol·L-1的ATO联合作用NB4细胞24、48和72h的凋亡率均较相应单独用药组凋亡率明显增高(P<0.05);染色荧光显微镜观察l.0μg·mL-1TanⅡA联合1.0μmol·L-1ATO实验组较1.0μmol·L-1ATO对照组72h时更易见到中晚期凋亡细胞和死亡细胞;(2)1.0μg·mL-1TanⅡA与0.5、1.0μmol·L-1的ATO联合作用NB4细胞48h、72h表达p53蛋白的细胞较1.0μmol·L-1ATO单药组明显增多(P<0.05),作用高峰时间为72h;1.0μg·mL-1TanⅡA分别与0.25、0.5、1.0μmol·L-1的ATO联合作用NB4细胞24h时,表达Bcl-2蛋白的细胞数较1.0μmol·L-1ATO单药组显著下降(P<0.05),且与ATO的浓度呈负相关(r=-0.858,P=0.000)。结论联合1.0μg·mL-1TanⅡA可增强0.5、1.0μmol·L-1ATO诱导NB4细胞凋亡;TanⅡA联合ATO诱导NB4细胞p53表达增强和Bcl-2表达减少可能是其促凋亡机制之一。

藏木香石油醚快速溶剂萃取物体外抑制肝癌细胞增殖活性研究

为充分开发利用藏药资源,对藏木香进行体外抗肝癌活性评价,并对活性部位的细胞毒活性及初步抗肝癌机制进行研究.运用快速溶剂萃取法制备藏木香的各溶剂提取物,采用MTT法、细胞形态学观察、Hoechst 33258荧光染色、流式细胞术和蛋白免疫印迹等分析藏木香各提取物抗肝癌活性及活性部位抗肝癌机制.藏木香石油醚提取物(IR-Pe)对HepG2和Hep3B都有良好的抗肝癌活性,其IC50值分别为21.9±2.3μg·mL^-1、27.6±2.5μg·mL^-1,且对正常肝细胞L-02在100μg·mL^-1未显示出毒性.IR-Pe对HepG2和Hep3B两个肝癌细胞株皆显示出显著的时效和量效关系;细胞形态学观察及流式细胞术显示IR-Pe明显的诱导肝癌细胞凋亡.IR-Pe明显地上调Bax和切割后的caspase-3蛋白的表达,同时下调Bcl-2蛋白的表达.IR-Pe具有良好的体外抗肝癌活性,其通过调控线粒体通路诱导肝癌细胞凋亡发挥抗肝癌活性,具有极大的开发应用潜力.

电子烟烟液体外毒理学评价用细胞筛选研究

【目的】目前,国内外尚无电子烟制品体外毒理学评价的统一方法,本研究旨在确定适合于电子烟制品体外毒理学评价用细胞。【方法】以人口腔角质细胞(HOK)、人鼻腔上皮细胞(RPMI 2650)、人支气管上皮细胞(Beas-2b)、人肺成纤维上皮细胞(HPF)、人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)为候选细胞,采用细胞毒性法和Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡试验作为评价方法,综合细胞的耐受性、细胞增殖特性及试验操作性选取适合于电子烟体外毒理学评价用细胞。【结果】细胞毒性和细胞凋亡试验结果均显示,不同的受试细胞对相同的样品测试结果定性结果一致,样品间相对定量趋势一致。候选检测用细胞的细胞倍增时间显示,在24 h的测试周期内,RPMI 2650细胞和HPF细胞的增殖较快。【结论】综合细胞的耐受性、细胞增殖特性及试验操作性,建议选取上呼吸道细胞RPMI 2650和下呼吸道细胞HPF为电子烟体外毒理学测试用细胞。

补脑软胶囊对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响

目的探讨补脑软胶囊对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法采用不同剂量的补脑软胶囊作用于经Aβ1-42诱导损伤的SH-SY5Y细胞24 h,采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡情况。结果与空白组比较,模型组SH-SY5Y细胞平均凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,多奈哌齐阳性对照组及补脑软胶囊内容物中、低剂量组SH-SY5Y细胞平均凋亡率均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论补脑软胶囊可减少经Aβ1-42诱导损伤引起的SH-SY5Y细胞凋亡,降低细胞凋亡率。

人锌指蛋白23在原发性肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的 分析hZNF23在人HCC组织及HepG2细胞系中的表达情况,以探讨其与HCC临床病理特征和细胞凋亡的关系.方法 采用实时荧光定量RT-PCR法检测37例HCC患者（按Edmondson分为两组,Ⅰ＋Ⅱ级17例,Ⅲ＋Ⅳ级20例;按临床分为3组,HCC合并肝硬化和HBV感染组31例,HCC合并肝硬化和HCC合并HRV感染组各3例）癌组织和其癌旁肝组织标本中hZNF23及内参GAPDH mRNA的表达水平,并分析其与HCC临床病理特征的关系;体外培养HepG2细胞后,分为4组（对照组、1.25、2.5和5 μg/ml顺铂组）或6组（对照组、1.25、2.5、5、10和20μg/ml顺铂组）.采用四唑盐比色法（MTT）和流式细胞仪膜联蛋白V/碘化丙啶染色法检测与观察HepG2细胞的增殖及凋亡情况;实时荧光定量RT-PCR法检测HepG2细胞在不同浓度的顺铂诱导凋亡后,hZNF23及内参GAPDH mRNA的表达水平.结果 37例HCC患者癌组织及其癌旁组织标本中hZNF23相对表达量分别为8.84（3.59～15.05）和22.20（13.85～42.90）,差异有统计学意义（U=259.5,P＜0.01）.Edmondson Ⅰ＋Ⅱ级HCC组织hZNF23 mRNA相对表达量为12.80（4.80～19.50）,高于Ⅲ＋Ⅳ级的5.01（2.88～11.68）,且差异有统计学意义（U=99.00,P＜0.05）;合并肝硬化组为9.92（3.80～15.25）,未合并肝硬化组为3.21（2.78～3.60）、合并HBV感染组为9.09（3.72～15.25）,无HBV感染组为2.48（1.79～12.10）,合并肝硬化组与未合并肝硬化组、合并HBV感染组与未合并HBV感染组比较,其hZNF23 mRNA表达量差异均无统计学意义（U值分别为16.00和24.00,P均＞0.05）.顺铂作用于HepG2细胞24 h后,用MTT检测,顺铂明显抑制HepG2细胞增殖;膜联蛋白V/碘化丙啶染色法检测细胞凋亡率依次为（0.9±0.2）%、（4.2±0.3）%、（9.8±4.3）%、（23.0±6.0）%,顺铂显著诱导HepG2细胞凋亡,且呈剂量依赖性（F=27.890,P＜0.01）.实时荧光定量RT-PCR法检测1.25、2.5、5μg顺铂诱导的HepGR细胞组hZNF23 mRNA相对表达量依次为（10.39±3.08）×10-5、（24.10±2.09）×10-5、（6.90±2.24）×10-4,均显著高于对照组[（9.48±1.80）×10-5,F=6.027,P＜0.01].结论 HCC组织中hZNF23相对表达水平与Edmondson分级密切关联;顺铂对HepG2细胞的凋亡作用可能与hZNF23上调有关.

叶下珠复方Ⅱ号对人肝癌HepG_2细胞增殖和凋亡作用

目的探讨叶下珠复方II号(CPU II)对体外培养的人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的作用。方法采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法),比较不同浓度的叶下珠复方在不同作用时间对体外培养的HepG2细胞增殖的影响;应用流式细胞术(FCM)结合Annexin V-FITC/PI荧光双染法观察CPU II诱导24h后人肝癌HepG2细胞的凋亡率。结果 MTT结果显示,人肝癌HepG2细胞经叶下珠复方II号处理一定时间后,增殖比率明显下降,2.60mg/ml以上的叶下珠II号对人肝癌HepG2细胞株的增殖有抑制作用(P<0.01;48h P<0.05),且呈一定的量效关系;FCM结果显示,随着叶下珠复方II号浓度的增加(2.6、26.0、130.0mg/ml),细胞的凋亡率也逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论叶下珠复方II号能够抑制人肝癌HepG2细胞生长和增殖,诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,呈明显的量效关系。

蒙药珍宝丸对新生大鼠缺氧性脑损伤脑组织的保护作用研究

目的:探讨蒙药珍宝丸对新生大鼠缺氧性脑损伤脑组织的保护作用。方法:取新生7天Wistar大鼠200只,雌雄不限,随机分成5组,每组40只;将新生Wistar大鼠置于8%O2+92%N2(V/V)的缺氧箱内建立新生鼠缺氧模型。在造模前每日一次连续7天灌胃给予生理盐水和珍宝丸,缺氧期间也同样剂量给药,分别于缺氧后12 h、24 h、48 h、72 h处死动物取血及脑组织。采用ELISA法检测大鼠血清及脑组织中IGF-1的蛋白含量;采用Annexin V/PI双染色法检测各组大鼠脑组织中神经元细胞凋亡率。结果:ELISA法检测结果显示,与正常对照组比较,大鼠血清及脑组织中IGF-1蛋白含量,在模型缺氧1h、4 h组均随时间的延续逐渐降低(P<0.01);珍宝丸缺氧1 h和4 h治疗组在12 h、24 h、48 h、72 h时间点IGF-1蛋白含量均略降低,12 h时间点差异有统计学意义(P<0.05),其他各时间点无统计学差异(P>0.05);1 h组在各时间点上明显高于4h组。Annexin V/PI双染色法检测结果显示,与正常对照组比较,模型缺氧1 h、4 h组均在24 h时间点细胞凋亡率最高,随时间的延续细胞凋亡率下降,至72 h时间点细胞凋亡率低于12 h(P<0.01);珍宝丸缺氧1 h和4 h治疗组12 h细胞凋亡率明显升高(P<0.01),24 h、48 h、72 h时间点细胞凋亡率略升高(P<0.01)。结论:珍宝丸可通过上调缺氧性脑损伤大鼠血清及脑组织中IGF-1蛋白含量,降低神经元细胞的凋亡率,从而对缺氧性脑损伤具有一定的保护作用。

日本血吸虫14d童虫凋亡现象的观察

为观察BALB/c小鼠源日本血吸虫14d童虫的细胞凋亡现象,分别采用TUNEL检测法和透射电子显微镜从DNA分子水平和细胞层面上进行定性观察,并应用FITC-Annexin-V/PI双染色法通过流式细胞仪定量检测虫体凋亡细胞比例。结果表明,采用这3种方法均能在日本血吸虫14d童虫中观察到一定程度的细胞凋亡现象,但不会导致日本血吸虫该时期童虫的异常生长发育。