鸡抗人B7同源物4(B7-H4)IgY多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人B7同源物4(B7-H4)IgY多克隆抗体,建立合适的双抗体夹心ELISA检测人血清中可溶性B7-H4(sB7-H4)蛋白。方法筛选人源B7-H4蛋白合适的B细胞表位肽免疫新海兰灰蛋鸡,收集鸡蛋纯化鸡抗人B7-H4 IgY抗体;检测抗体的纯度、浓度及效价,并用ELISA、Western blot、流式细胞术验证抗体的特异性和功能;建立双抗体夹心ELISA法并检测临床样本;同时采用商品化的ELISA试剂盒对相同样本进行对比检测。结果制备了鸡抗人B7-H4 IgY抗体并证明该抗体对人B7-H4蛋白有高特异性;采用该抗体检测临床样本发现卵巢癌和良性卵巢肿瘤患者血清中sB7-H4含量明显高于健康人,这与使用商品试剂盒获得的检测结果一致;采用IgY抗体建立的ELISA灵敏度高于商品试剂盒。结论成功制备了鸡抗人B7-H4 IgY多克隆抗体,并用其建立了一种适合检测人血清中sB7-H4蛋白的双抗体夹心ELISA。

IgY在抗病毒医学领域中的应用

免疫球蛋白Y(immunoglobulin Y,IgY)作为一种潜在的治疗性抗体,存在于许多物种内,从低等的两栖类、爬行类到高等动物鸟类等。疫苗的研发成为全球科学家与病毒“赛跑”的竞争主场。疫苗虽能有效预防病毒的感染,降低疾病的发生率和死亡率,但其开发耗时且成本高昂。IgY具有易生产、成本低、起效快的优点,近年来基于IgY的抗体治疗策略得到广泛认可。概述了IgY特性的最新研究和生产技术的进展,综述了IgY在病毒性疾病治疗方面的应用,从而为IgY在病毒感染性疾病治疗领域的应用提供一些启示。

抗轮状病毒IgY的研制

目的用鸡卵黄制备抗轮状病毒（ＲＶ）免疫球蛋白，预防和治疗婴幼儿ＲＶ感染。方法制备ＲＶ 抗原，通过不同途径免疫母鸡，几种纯化方法联合应用从鸡卵中提取特异性鸡卵黄抗体（ＩｇＹ），进行理化学检定及动 物效力实验。结果免疫母鸡均可产生特异性ＩｇＹ，纯度可达９１％以上，产量为４４ｍｇ／蛋；可保护乳鼠兔受ＲＶ攻击； ＩｇＹ耐热、耐酸，室温保存半年、４℃两年效价不变。结论已成功地应用ＲＶ免疫母鸡制备出高效价特异性抗ＲＶ－ＩｇＹ。

鸡卵抗体(IgY)理化特性的研究

本文研究了抗脊髓灰质炎病毒Ⅲ型鸡卵抗体（IgY）的理化特性，实验证明IgY在室温条件下能保持活性6个月，经巴氏消毒后抗体活性不丧失，并且具有很好的耐酸性，研究结果提示特异性IgY可作为良好的婴幼儿食品添加剂。

鸡卵黄抗体IgY的分离纯化及鉴定

采用水溶稀释法结合硫酸钠二次盐析沉淀法分离纯化鸡卵黄中蛋白IgY,实验中比较了不同pH值的水溶稀释液对卵黄除脂效果的影响;并采用SDS-PAGE及western blotting对提取产物进行鉴定。结果显示,pH值5.2水溶稀释液除脂效果最好,IgY得率最高。实验优化了鸡卵黄抗体IgY分离纯化技术,得到的IgY产量高、纯度高,特异性强;此外,水溶稀释法制备IgY具有利用小体积样品获得大量蛋白及纯化效率高的优点。

鸡蛋黄抗体IgY的急、慢性毒性实验

目的 :通过观察实验动物使用鸡蛋黄抗体IgY后的急、慢性毒性反应 ,评估鸡蛋黄抗体IgY的安全性。方法 :昆明小鼠 ,雌雄各 10只 ,鸡蛋黄抗体IgY喷漱液经口灌胃连续 1周 ,并记录动物中毒症状及死亡情况。Wistar大鼠 80只 ,分为受试物低、中、高剂量组 ,经口灌胃 30d后 ,观察大鼠血液生化指标及脏器变化。结果 :1周内小鼠未见明显中毒症状和死亡发生。 30d后大鼠临床检查、血液、生化、脏器组织病理学等项目测定均无异常。结论 :按急性毒性分级 ,IgY属无毒级类物质 ,且无慢性毒性表现。

水稀释法分离卵黄IgY

用水稀释法分离蛋黄中的免疫球蛋白 Ig Y,研究稀释度、稀释液 p H和温浴时间对分离效果的影响 .结果表明 ,用 7倍无菌水稀释蛋黄 ,调节 p H=5.0 ,在 4℃下温浴 5h,可获得较好的分离效果 ,Ig Y的回收率为 92 % .分离的 Ig Y用硫酸铵和硫酸钠盐析纯化 ,Ig Y的纯度达到 97% ,回收率达到 94% .通过对 Ig Y稳定性的研究表明 ,Ig Y对热、酸和冻融有良好的稳定性 .

抗金黄色葡萄球菌IgY的酶解稳定性及活性研究

目的:考察抗金黄色葡萄球菌特异性IgY的酶解稳定性和酶解产物的活性。方法:以灭活的金黄色葡萄球菌免疫产蛋母鸡,抗体经水稀释及盐析分离纯化。抗体在不同条件下经胃蛋白酶或胰蛋白酶消化。抗体及酶解产物的特异性和活性分别用ELISA法和凝集法检测,酶解产物用SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。结果:免疫产生的抗体具有特异性,能与金黄色葡萄球菌凝集而抑制其生长。分离纯化后抗体纯度与标准IgY相近。IgY在pH<4时完全酶解;pH等于4时部分酶解生成Fab片断,具有特异性和凝集活性;pH>4时,抗体稳定,不发生酶解。结论:抗金黄色葡萄球菌特异性IgY及其酶解生成的Fab片断,具有特异性和抑菌活性,有望代替抗生素用于细菌感染性疾病的治疗。

鸡新城疫卵黄抗体IgY的分离提纯研究

本文对母鸡经鸡新城疫疫苗免疫接种后产生并富集在卵黄中的抗体IgY的提取纯化工艺条件进行了研究与优化,确定了去脂、提取抗体最佳工艺为:卵黄液用0.05mol/L,pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液1∶9倍稀释,搅拌15min,4℃静置10小时,抗体回收率为90%,去脂率为99%;该提取液用40%饱和度的硫酸铵盐析,得到的盐析液抗体回收率为82%,纯度达到69%。盐析液经截留分子量为100KD的有机陶瓷膜超滤后,截留液抗体回收率达到92%,纯度为85%。

抗哇巴因鸡蛋黄IgY与兔抗体IgG在酶联免疫检测中的比较

目的:探讨提高内源性哇巴因(EO)检测方法的准确性及特异性,为哇巴因的研究打下基础。方法:分别制备出鸡蛋黄抗哇巴因多克隆抗体及兔抗体。然后采用酶联免疫吸附法(ELISA)比较两种抗体检测内源性哇巴因的准确性及特异性。结果:采用IgY检测EO的平均批内变异系数为2.03%,批间变异系数为2.34%。兔抗体IgG则分别为2.83%、3.29%;两者均与氢化可的松及地塞米松无交叉结合反应,与西地兰和地高辛分别存在3.45%vs5.95%、3.20%vs5.20%的交叉反应。结论:IgY比兔抗体ELISA检测内源性哇巴因的特异性及准确性较高。

利用鸡蛋特异性抗体IgY的免疫亲和色谱

以牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为抗原，利用偶联上ＢＳＡ的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ的亲和色谱材料从鸡蛋蛋黄中一步分离特异性抗ＢＳＡ 抗体。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、双向免疫扩散检验，所洗脱的样品为电泳纯的特异性抗体。反之，将所得抗体再偶联到ＰＯＲＯＳＨＹ上可分离抗原。同时考察了母鸡免疫过程中特异性抗体随时间的变化趋势。

抗HPV16L1IgY抗体的制备及活性检测

目的制备出高特异性的抗HPV16L1IgY抗体,为HPV16L1蛋白的检测提供一种方法。方法用纯化HPV16L1蛋白免疫母鸡,分别收集鸡蛋,4℃下保存备用;经聚乙二醇法提取鸡蛋黄中IgY抗体;用酶联免疫吸附法检测IgY抗体效价的测定;采用免疫组织化学法通过对转染pcDNAEGFP-HPV16L1(含EGFP-HPV16L1融合基因)质粒的CHO细胞中L1蛋白的检测评价IgY抗体的特异性。结果3次免疫之后,IgY抗体效价达到1:10240,同时可特异性与转染pcDNAEGFP-HPV16L1(含EGFP-HPV16L1融合基因)质粒的CHO细胞中EGFP-HPV16L1结合。结论采用HPV16L1蛋白免疫母鸡,成功获得了较高效价的特异性IgY抗体,并可用于HPV16L1蛋白的细胞学检测,为IgY抗体在免疫组织化学检中的应用提供实验依据。

卵黄抗体IgY检测血吸虫病人循环抗原的初步研究

目的探讨抗可溶性虫卵抗原(SEA)卵黄抗体(IgY)检测血吸虫循环抗原的应用价值。方法以纯化的鸡IgY作为捕捉抗体,以酶标抗SEA单克隆抗体NP28-5B为检测抗体的双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(S-ELISA)检测急、慢性血吸虫病人和健康人血清,并与常规检测抗体的酶联免疫吸附试验法(SEA-ELISA)作比较。结果S-ELISA测得SEA浓度(y)与吸光度(A450)值(x)呈明显的正相关(y=459.22x-108.14,r=0.9481)。急性血吸虫病人循环抗原的阳性率为100.00%(9/9),慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率为84.44%(38/45),健康人的特异性为96.00%(48/50)。两种方法对血吸虫病的检出率差异无统计学意义(P>0.05)。结论S-ELISA具有较好的敏感性和特异性,可用于血吸虫病免疫诊断。

IgY抗体作为导向载体对消化系统肿瘤的选择性识别作用研究

用生物治疗方法治疗肿瘤已被视为肿瘤治疗的第四大疗法，其主要是免疫治疗，包括抗体与偶合物，肿瘤疫苗等。而要想获得有效的肿瘤治疗药物，其关键是要寻找小型化的、高效的导向载体。我们的实验室以低分化腺胃癌的Ｐ１１０癌蛋白作为抗原，免疫ＳＰＦ鸡，从卵黄中提取抗体ＩｇＹ作为植物毒素的导向性载体；实验结果证明，ＩｇＹ能特异性地选择识别消化系统的肿瘤组织。

抗白色念珠菌IgY的稳定性与应用研究

目的 观察抗白色念珠菌鸡蛋黄抗体IgY的稳定性与体外生物学效应。方法 用水溶法从免疫鸡蛋黄中提取抗白色念珠菌抗体IgY ,ELISA法检测抗体耐热、耐酸、耐碱的稳定性 ,观察IgY抑制白色念珠菌生长和抑制白色念珠菌粘附肠上皮细胞(IEC 6)。结果 IgY在巴氏消毒后活性为对照的 61 % ,在pH 7 0至 3 0酸性环境中活性改变不显著 ,在pH 7 9,37℃作用 1 50min活性仍为对照的 60 %。IgY在 1 0mg/ml时能明显抑制白色念珠菌生长和对肠上皮细胞的粘附 ,明显降低细胞上清二胺氧化酶(DAO)释放。结论 鸡蛋黄抗体IgY具有高度稳定性和良好的体外生物学效应。

日本血吸虫可溶性虫卵抗原经两种免疫途径获得的鸡卵黄抗体IgY动态观察

目的对比两种免疫途径产生抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异性IgY抗体水平动态变化。方法7只新西兰兔感染日本血吸虫尾蚴(1500/只)42d后解剖收集虫卵,制备SEA。将SEA分别经皮下和静脉注射免疫健康海蓝蛋鸡(3只/组),首次和第2次免疫间隔2周,之后每次间隔4周,共免疫5次,50μg/(只·次)。取两组免疫前,以及首次免疫后2～18周生产的鸡蛋,用水稀释法粗提IgY,ELISA检测每2周IgY的动态变化。IgY纯化试剂盒(EGGstract IgY Purifiction System)纯化静脉组首次免疫后8～18周的IgY,紫外吸收法检测抗体浓度,琼脂糖双扩散法和ELISA检测IgY峰值水平的抗体效价,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析比较免疫前后抗体特异性。结果静脉组和皮下组分别在首次免疫后8和12周IgY抗体水平达高峰,A492值分别为1.28和0.78,静脉组IgY水平至18周仍维持较高水平,皮下组抗体水平达到峰值后逐渐下降。纯化后IgY浓度约为6.5～9.0mg/ml,琼脂糖双扩散法和ELISA测得静脉注射组峰值水平抗体效价分别为1∶16和1∶51200。经SDS-PAGE和Western blotting分析,纯化后的IgY在相对分子质量(Mr)25000和68000处各有一条清晰条带,且免疫后IgY可与SEA发生特异性反应。结论静脉注射法比皮下注射法能获得更高水平的鸡抗日本血吸虫SEA特异性IgY抗体,且纯化后的IgY抗体具有较好的特异性。

疏水性电荷诱导层析纯化免疫球蛋白IgY

利用疏水性电荷诱导层析(HCIC)从鸡血中分离免疫球蛋白IgY。采用经辛酸预处理后的血浆上清液作为原料,直接用HCIC分离纯化IgY。考察了两种HCIC介质,市售介质MEP HyperCel和实验室自制介质Bestarose-DVS-MMI,优化了上样pH、洗脱pH和上样量等条件。研究发现,以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的Bestarose-DVS-MMI介质优于MEP HyperCel介质,前者分离IgY的纯度和收率较高,HPLC分析IgY纯度可达92%以上,收率约95%。通过配基结构比较和表面电势分析,探讨了HCIC分离IgY的机制。结果表明,采用HCIC可以实现IgY的高效分离,为从血液中分离免疫球蛋白提供了新方法。

特异性抗P.g-IgY龈下冲洗液对中度和重度慢性牙周炎的疗效观察

选择60例中度或重度慢性牙周炎患者,用特异性抗P.g-IgY龈下冲洗液前后,观察牙周临床指标变化,通过BANA实验评价患者口腔各部位牙周致病菌含量的变化。用药后附着丧失、松动度、探诊出血百分比、菌斑占有率、深牙周袋比例均减小且以抗P.g-IgY龈下冲洗液组改善效果最为显著。BANA实验结果表明该龈下冲洗液可显著减少牙周袋和唾液中的牙周致病菌。特异性抗P.g-IgY龈下冲洗液临床疗效好,可作为中度或重度慢性牙周炎的辅助治疗手段,有较高的临床推广价值。

抗龋IgY和IgY牙膏对体外培养变形链球菌影响的电镜观察

目的 :观察抗龋IgY和IgY牙膏对变形链球菌超微结构的影响 ,为探讨IgY的防龋机制提供形态学资料。方法 :体外厌氧培养变形链球菌 ,用不同浓度抗龋IgY和IgY牙膏处理菌细胞 ,并对培养出的菌细胞做透射电镜和扫描电镜观察。结果 :①透射电镜。经抗龋IgY处理的变形链球菌 ,细胞壁不完整 ,细胞壁最外层荚膜溶解消失 ;经IgY牙膏处理的变形链球菌除上述变化外 ,部分菌细胞结构破坏 ,菌体溶解。②扫描电镜。经抗龋IgY处理的变形链球菌 ,其长链菌减少 ,菌体表面光滑。结论 :抗龋IgY可导致变形链球菌细胞壁损伤。由于细胞壁具有的黏附作用丧失 ,导致菌体黏附牙面的能力下降和菌斑形成减少 ,从而达到抗龋作用 ;IgY牙膏膏体中的成分可能对菌细胞有破坏作用。

抗旋毛虫肌幼虫ES抗原IgY的制备及鉴定

目的制备抗旋毛虫肌幼虫排泄-分泌(excretory-secretory,ES)抗原的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),测定其效价及用于检测抗原的敏感性。方法 4只24w龄罗曼母鸡用旋毛虫肌幼虫ES抗原经大腿外侧与胸部肌肉免疫4次(首次剂量为500μg/只,加强剂量为250μg/只),每次间隔10d。取免疫前和首次免疫后42d的鸡蛋卵黄,用水稀释法提取IgY,考马斯亮蓝法测定蛋白含量,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blot)及间接荧光抗体试验(IFAT)对IgY进行分析,ELISA检测纯化后IgY的效价及检测抗原的敏感性。结果罗曼鸡经ES抗原免疫后,每枚鸡蛋经提纯后均可得到约70mg抗体,SDS-PAGE表明纯化的IgY有2条主要蛋白带,分子量为67kDa、23kDa,Western blot与IFAT发现提纯的IgY可识别肌幼虫虫体与ES抗原。IgY的抗体效价为1∶107,IgY-夹心ELISA检测旋毛虫抗原的敏感性为1.17ng/mL。结论制备的抗旋毛虫ES抗原的IgY具有较高的效价与敏感性。