融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响

目的探讨抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响。方法采用健康人富含血小板血浆以凝胶过滤法分离得到人血小板。流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5或小鼠抗人CD42b(glycoprotein Ibα,GPIbα)单克隆抗体(HIP1)与血小板的结合情况;以人血小板表面P-选择素的表达及PAC-1的结合反映血小板的激活程度;以全血电阻法定量分析TAP-SSL5对人血小板聚集功能的影响;为评价TAP-SSL5的出血风险,进一步观察了TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响。结果融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合,并竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合,进而抑制GPIbα与vWF的相互作用。但高浓度的TAP-SSL5(终浓度30 mg/L)也能激活血小板,使人血小板表面P-选择素的表达增加(表达阳性率为90.4%)和PAC-1的结合量上升(阳性率为66.3%);终浓度为10、30 mg/L的TAP-SSL5可引起血小板的显著聚集。给小鼠单次尾静脉注射10 mg/kg的TAP-SSL5,可显著延长尾部出血时间,由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(P<0.01);而常规剂量组(3 mg/kg TAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s,与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结论融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能,有助于进一步提高TAP-SSL5的抗血栓作用,但同时也导致融合蛋白TAP-SSL5在高浓度情况下可延长出血时间和激活血小板。

抗炎、抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5表达载体的构建及其功能研究

目的构建一种具有抗炎和抗凝双效功能的融合蛋白,并对其功能进行初步鉴定。方法将重组金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5(staphylococcal superantigen-like protein-5,SSL5)与蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)融合,从金黄色葡萄球NCTC8325菌株中克隆SSL5基因;经DNA重组技术,将编码pelB前导序列、SSL5和TAP的基因重组并克隆于原核表达载体pHOG21中,再转染于大肠杆菌BL21中扩增表达,制备融合蛋白SSL5-TAP或TAP-SSL5,采用流式细胞仪检测融合蛋白是否和SSL5一样,具有与粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)结合的特性;采用反应底物法在体外检测融合蛋白对活化的凝血因子X(factor Xa,FXa)活性的抑制作用。结果TAP-SSL5保留了SSL5与PSGL-1结合的特性,并且融合蛋白TAP-SSL5可显著抑制FXa的活性(P<0.01),抑制率达39.5%。结论融合蛋白TAP-SSL5是一种以PSGL-1为靶向的新型抗炎、抗凝双效分子。

^125I标记融合蛋白TAP-SSL5在健康大耳兔体内的药代动力学研究

目的研究125I标记的抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5单次静脉注射后在健康日本大耳兔体内的药代动力学过程。方法采用固相氧化法(Iodogen法)将Na125I直接标记于TAP-SSL5,由耳缘静脉给每只大耳兔注射18.5×103kBq的125I-TAP-SSL5,分别于注射后1.5、3、5、10、30、60、120、240、480 min采血,称量并测定放射性计数(Counts per minute,cpm),换算为血液放射性浓度,经DAS软件分析得出最佳房室模型及相关药代动力学参数。结果纸层析法测得125I-TAP-SSL5的标记率为(67.32±9.91)%,放射化学纯度为(91.62±3.22)%,比活度为(30.2±4.4)TBq/μmol;TAP-SSL5在大耳兔体内的药代动力学过程符合权重为1的二室模型,分布相半衰期(t1/2α)及消除相半衰期(t1/2β)分别为(0.08±0.04)h和(4.97±0.75)h,清除率(Clearance,CL)为(0.015±0.011)ml/h,一室向二室转运常数(K12)为(6.651±3.642)/h,二室向一室转运常数(K21)为(4.072±1.737)/h。结论125I-TAP-SSL5在健康大耳兔体内的药代动力学过程符合权重系数为1的二室模型,自体清除率缓慢,可保证与组织有更多的结合几率。

融合蛋白TAP-SSL5对血小板与粒细胞结合的影响

目的探讨融合蛋白TAP-SSL5对血小板与粒细胞结合作用的影响。方法采用CCK-8试剂盒检测TAP-SSL5对细胞活力的影响;流式细胞仪检测THP-1细胞表面CD162(PSGL-1)的表达,及TAP-SSL5对小鼠抗人CD162单抗KPL-1与THP-1细胞结合的抑制作用。以20μmol/L ADP激活人血小板,采用流式细胞仪、瑞氏-姬姆萨染色检测血小板与THP-1细胞或人中性粒细胞的结合情况,并研究TAP-SSL5的干预作用。结果 TAP-SSL5浓度在30 mg/L或以下时对THP-1细胞或中性粒细胞的活力无明显影响。流式细胞仪检测显示,TAP-SSL5(终浓度10 mg/L)能显著抑制KPL-1与THP-1细胞的结合;20μmol/L ADP激活的血小板与THP-1细胞或中性粒细胞的结合率分别为(31.3±8.4)%和(35.6±5.9)%;细胞经10 mg/L TAP-SSL5预先处理后,其结合率分别降至(13.4±6.7)%和(10.4±6.4)%(P<0.01)。瑞氏-姬姆萨染色的结果表明,TAP-SSL5和SSL5均可抑制激活的血小板与中性粒细胞的结合(P<0.05)。结论 TAP-SSL5可通过与PSGL-1的结合,而直接抑制激活的血小板与粒细胞的结合。

融合蛋白TAP-SSL5对血小板微粒与THP-1细胞结合及Mac-1活化的影响

目的探讨融合蛋白TAP-SSL5对血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)与人单核细胞株THP-1细胞结合及Mac-1活化的影响。方法以二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)激活人血小板并获取PMPs。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)及PE标记的抗CD62P单克隆抗体、FITC标记的Annexin V检测PMPs,以FITC标记的抗CD41单克隆抗体和PE标记的抗CD154(CD40L)单克隆抗体检测PMPs的表面特征。采用JC-1试剂盒检测血小板线粒体膜电位。采用FCM检测PMPs与THP-1细胞的结合,以及PMPs诱导THP-1细胞表面Mac-1(CD11b/CD18,αMβ2)的活化情况,并研究TAP-SSL5的干预作用。结果 PMPs呈现CD62P和Annexin V双阳性,且CD41和CD40L的阳性率分别达到50.8%和44.0%。JC-1检测显示,ADP对血小板线粒体膜电位无明显影响(P>0.05)。PMPs与THP-1细胞的结合率为(24.80±5.16)%,PMPs诱导THP-1细胞Mac-1的活化率为(21.17±5.92)%,THP-1细胞经10 mg/L TAP-SSL5预处理后,PMPs的结合率下降至(13.67±2.15)%(P<0.05),Mac-1的活化率下降至(0.99±0.62)%(P<0.01)。结论 TAPSSL5可抑制PMPs与THP-1细胞的结合及THP-1细胞表面Mac-1的活化。

蜱源抗凝分子及其作用机制

综述了血液凝固过程、血凝因子和血小板在血凝过程中的作用;总结了自 1990 年发现第一个蜱源抗凝血分子(TAP)以来分离鉴定出的蜱源抗凝血活性分子及其它们的抗凝机制及基于蜱抗凝多肽和 cDNA 克隆表达出的几种抗凝血分子,介绍了近年来在 TAP 的分子结构和抗凝机制方面的研究进展.

融合蛋白TAP-SSL5对激活的血小板与人淋巴细胞结合的影响

目的:研究抗炎、抗凝双效融合蛋白蜱抗凝血肽(TAP)-金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白5(SSL5)对激活的血小板与人淋巴细胞结合作用的影响。方法:采用免疫磁珠分选法筛选人外周血总淋巴细胞;CCK-8法检测TAP-SSL5对细胞活力的影响;流式细胞术检测Jurkat细胞(人外周血白血病T细胞株)表面CD162(PSGL-1)的表达及TAP-SSL5对小鼠抗人CD162单抗(KPL-1)与Jurkat细胞结合的抑制作用。以20μmol/L ADP激活人血小板,流式细胞术检测血小板与Jurkat细胞或人淋巴细胞的结合情况,并研究TAP-SSL5的干预作用。结果:30mg/L及以下浓度的TAP-SSL5对Jurkat细胞的活力无明显影响。流式细胞术检测显示,10 mg/L的TAP-SSL5能显著抑制KPL-1与Jurkat细胞的结合;20μmol/L ADP激活的血小板与Jurkat细胞或淋巴细胞的结合率分别为(11.86±4.49)%和(8.32±1.00)%;细胞经10 mg/L TAP-SSL5预先处理后,结合率分别降至(6.73±2.71)%和(5.51±0.70)%,差异有统计学意义。结论:TAP-SSL5可与淋巴细胞表面的PSGL-1结合,从而抑制激活的血小板与人淋巴细胞的结合,这可能是抗炎、抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5发挥其抗炎作用的机制之一。

含RGDS的蜱抗凝血肽表达体系的构建

目的人工合成含RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)重组蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)基因,进行原核表达,获得融合蛋白,用表达的融合蛋白粗提取物进行凝血实验。方法参照天然TAP的氨基酸序列,设计了含RGDS的编码63个氨基酸的213个碱基(含酶切位点所加的碱基),进行全基因合成后转导入大肠杆菌DH5α中。挑选阳性克隆,并进行诱导表达,检测产物的抗凝血性质。结果PCR和核苷酸序列测定表明TAP-RGDS构建正确,在IPTG诱导下的表达产物有抗凝血活性。结论构建了重组TAP-RGDS基因,该基因能表达出有抗凝血活性的产物。

融合蛋白TAP-SSL5抑制动静脉血栓形成

目的:探讨重组抗炎、抗凝双效融合蛋白蜱抗凝血肽(TAP)-金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5(SSL5)对动静脉血栓形成的影响和机制。方法:采用基因重组技术构建TAP-SSL5基因,进而制备融合蛋白TAPSSL5,通过流式细胞检测技术研究重组蛋白TAP-SSL5与粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)结合的特性;采用反应底物法在体外检测融合蛋白TAP-SSL5对活化的凝血因子Xa(factor Xa,FXa)活性的抑制作用。采用Fe Cl3诱导的SD大鼠下腔静脉血栓模型,研究TAP-SSL5对静脉血栓形成的影响;采用Fe Cl3诱导的C57BL/6J小鼠肠系膜动脉血栓模型,在双光子显微镜下连续检测TAP-SSL5对动脉血栓形成的影响。结果:TAP-SSL5可与粒细胞表面PSGL-1结合,并抑制粒细胞与P-selectin和血小板的结合。TAP-SSL5呈剂量依赖性地抑制FXa活性(P <0. 01)。体内实验中TAP-SSL5可明显抑制Fe Cl3诱导的SD大鼠下腔静脉及C57BL/6J小鼠肠系膜动脉血栓的形成。结论:融合蛋白TAP-SSL5具有抗炎和抗凝双重效果,可以明显抑制动静脉血栓的形成。

抗炎抗凝融合蛋白TAP-SSL5对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变形成的影响

目的:探讨重组融合蛋白蜱抗凝血肽(TAP)-金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白5(SSL5)对Apo E基因敲除(Apo E^(-/-))小鼠动脉粥样硬化病变形成的影响。方法:选取12周龄雄性Apo E^(-/-)小鼠21只,随机分为3组:TAP-SSL5组(3 mg·kg^(-1)·d^(-1))、SSL5组(2 mg·kg^(-1)·d^(-1))、空白对照组(p H 7.4磷酸盐缓冲液),ip,qd,连续给药12周,观察小鼠体质量变化。高脂饮食饲养12周后取材,检测血浆总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;对小鼠主动脉血管进行石蜡切片,常规HE染色,分析小鼠主动脉根部血管动脉粥样硬化斑块的形成情况,小鼠主动脉内膜面采用油红O染色,比较动脉粥样硬化斑块的分布情况。结果:高脂饲养12周后,与空白对照组比较,TAP-SSL5组小鼠体质量增长和TC水平明显降低(P<0.001),而TG、HDL-C、LDL-C水平无明显变化。HE染色结果表明,TAP-SSL5组主动脉根部切片斑块面积明显降低(P<0.05);主动脉大体标本斑块油红O染色提示TAP-SSL5干预组主动脉动脉粥样硬化斑块形成明显小于空白对照组。结论:TAP-SSL5可显著抑制Apo E^(-/-)小鼠动脉血管粥样硬化斑块的形成。

抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对大鼠长期毒性研究

目的研究抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对大鼠的长期毒性,评价其用药安全性。方法 SD大鼠隔天腹腔注射给药TAP-SSL5 1 mg/kg一次,连续给药8周,恢复1周,检测大鼠一般行为状态、体质量变化、血液常规及血液生化、脏器系数等指标。结果各组大鼠一般行为状态正常、体征正常、体质量无明显异常;血液常规和生化指标未见异常变化;各组动物器官组织病理检查未见明显异常;各组间脏器重量及脏器系数未见明显差异。结论融合蛋白TAP-SSL5对大鼠长期毒性小,提示其用药安全性较高。

蜱抗凝血肽与RGDS肽重组基因的酵母表达载体构建

目的构建蜱抗凝血肽与RGDS肽重组基因,将其克隆到甲醇酵母,建立分泌表达载体pPIC9K。方法设计、合成蜱抗凝血肽与RGDS肽的双功能分子的重组基因,对人工合成的目的基因片段进行酶切、测序鉴定。运用PCR技术,扩增目的基因,PCR产物经胶回收后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PCR、酶切鉴定和DNA测序证明双功能基因重组质粒构建成功。结论该方法能方便、高效地获得所需的多拷贝基因,为下一步在毕赤酵母中表达双功能分子蛋白建立了基础。

嵌合KGDS基序的蜱抗凝血肽突变体基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的设计含赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸基序(KGDS)的蜱抗凝血肽(TAP)突变体基因序列,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中与硫氧还蛋白(Trx)融合表达,以获得Trx-TAP-KGDS融合蛋白。方法人工合成目的基因,定向克隆于含Trx基因的高效原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-TAP-KGDS,并转化BL21感受态菌,以PCR及双酶切鉴定阳性克隆;含正确重组质粒的工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果重组质粒经PCR及双酶切鉴定,均获得约209 bp的基因片段,与预期大小一致;SDS-PAGE分析显示,含重组质粒的工程菌在IPTG的诱导下高效表达分子质量单位约为24 ku的蛋白质,该蛋白以水溶性形式为主。结论构建了含KGDS基序的TAP突变基因的原核表达载体pET32a(+)-TAP-KGDS,并成功进行了融合表达,为进一步研究其抗凝血活性打下了基础。

抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5的药理学分析

目的分析抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对动物的药理作用,为其安全性用药提供实验依据。方法取昆明(KM)小鼠,经尾静脉分别注射1、3和9 mg/kg TAP-SSL5,观察其对小鼠神经系统的影响;取SD大鼠,经尾静脉分别注射1和3 mg/kg TAP-SSL5,设溶剂[20 mmol/L甘氨酸(Gly)-NaOH缓冲液,pH 10.6]为对照组,观察其对呼吸系统和心血管系统的影响。结果 TAP-SSL5对KM小鼠一般行为状态、协调机能和戊巴比妥钠阈下剂量催眠的协同作用无明显影响;对SD大鼠的血压、呼吸频率和心率无明显影响,与溶剂对照组比较,差异无统计学意义(P均>0.05)。结论融合蛋白TAP-SSL5对动物的神经系统、呼吸系统和心血管系统无明显影响,表明其具有较好的安全性,且无明显的毒副作用。