Transformation of TrxS Gene into Barley by Particle Bombardment

The production of malting barley in China can＇t meet the demand of beer industries because of poor quality and it becomes a bottleneck problem in beer manufacture industry. In this paper, TrxS gene cloned from Phalaris coerulescens was transferred into barley cultivar Yupi 1 （YP1） via biolistic bombardment. 1206 immature embryos were bombarded and seven transgenic plants carrying TrxS gene were confirmed by PCR and PCR-Southern blotting analysis. TrxS gene was expressed in transgenic plants by RT-PCR analysis. The activity of Trxh and α-amylase of transgenic line were higher than that of non-transgenic line, which is helpful to improve malting quality of barley.

拟南芥TRX-h5基因的克隆和表达分析

硫氧还蛋白(TRX-h)是一类催化二硫键还原的小分子蛋白,在调控氧化应激响应中发挥重要作用。为了研究硫氧还蛋白的结构及其功能,文章以野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia(Col-0)为研究材料,通过反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术获得TRX-h5基因的编码序列(coding sequence,CDS),体外构建pET28a(+)-TRX-h5及pET28a(+)-TRX-h5M(第39位和第42位半胱氨酸位点突变)的原核表达载体,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,诱导后经镍柱纯化得到带有6个His标签的融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳技术检测到14 kDa处的目的条带,与理论值预测一致。运用生物信息学分析得出,TRX-h5基因编码118个氨基酸,相对分子质量为13122.32,理论等电点为5.19,该蛋白的不稳定参数为26.74,属于稳定性蛋白。点突变分析发现,TRX-h5的第39位和第42位半胱氨酸位点决定了该蛋白的催化活性,为进一步探究TRX-h5的蛋白功能和高等植物氧化还原系统的研究提供了新思路。

大麦转化体系的改进及TrxS基因的转化

以啤酒大麦品种"晋引6号"的幼胚为转化起始材料,用基因枪法将分别携带有目的基因(TrxS)和除草剂基因(筛选基因,Bar)的两个质粒进行了共转化,同时对基因转化的相关技术和植株再生的培养方案进行了优化。结果表明,受体材料宜选用预培养15d的幼胚;在培养前2周添加1mg/LABA可抑制胚芽萌发而且有助于胚性愈伤组织的形成;1.0mg/LZT与0.1mg/LIAA激素配比可有效促进愈伤组织的分化。利用优化的培养条件,经在含3～5mg/L筛选剂PPT的培养基上筛选、再生及生根培养。共在178块抗性愈伤组织上获得11株再生植株,再生率达到6.2%,经对T0、T1、T2代PCR、nestedPCR和Southern杂交检测表明,TrxS基因已经稳定整合到大麦基因组中且遗传稳定、结构完整。

小麦花粉管通道及子房注射法转化Anti-TrxS基因

为了获得抗穗发芽转基因小麦材料,以13个小麦品种 品系 为受体材料,用花粉管通道及子房注射法进行了硫氧还蛋白反义基因 Anti-TrxS 的遗传转化.花粉管通道法共转化小花2036朵,收获T0代种子1616粒,结实率为79.4%,将T0代种子大田点播,获T1代苗1424株,出苗率为88.1%.对T1代株系叶片基因组DNA进行PCR检测,31个株系中有16个株系呈阳性反应.子房注射法共转化小花1206朵,收获种子89粒,结实率为7.4%,T1代共出苗41株,出苗率为46.1%,对郑新991T1代株系进行PCR检测,电泳结果呈阳性反应.

转反义trxs基因小麦籽粒蛋白组分的巯基含量与α-淀粉酶活性的关系

利用反义trxs基因特异引物,对扬麦5号转反义trxs基因株系00TY5的T4和T5代进行了PCR分子鉴定,并对其纯合株系籽粒蛋白质组分的巯基含量、α-淀粉酶活性及二者的相关性进行了测试。结果表明,00TY5的T4和T5代PCR分子检测均呈阳性。与非转基因植株相比,在籽粒成熟和后熟过程中,籽粒清蛋白巯基含量在开花后30 d至成熟后5 d平均降低33.2%,球蛋白巯基含量在开花后20 d至成熟后5 d平均降低42.5%,均达极显著水平(P<0.01);醇溶蛋白和谷蛋白巯基含量有下降的趋势,但降低幅度较小;α-淀粉酶活性低,变异小,尤其在开花后35 d至成熟后10 d,平均比非转基因植株下降36.5%。各种蛋白质组分的巯基含量与α-淀粉酶的活性呈正相关关系,清蛋白巯基含量在成熟前与α-淀粉酶活性相关性达极显著水平(P<0.01);球蛋白巯基含量在成熟前10 d至成熟后10 d达显著水平(P<0.05);贮藏蛋白巯基含量与α-淀粉酶活性的相关性在各时段均较高。

TrxS基因的表达及其对大麦种子淀粉酶活性的影响

【目的】分析TrxS基因对大麦种子发芽及淀粉酶活性的影响,为TrxS基因对大麦种子代谢的调控提供了理论依据。【方法】以转TrxS基因啤酒大麦株系为材料,从分子水平和生理指标进行分析。【结果】实时荧光RT-PCR检测证明TrxS基因在RNA水平上能够表达;转基因大麦籽粒α-淀粉酶和β-淀粉酶活性明显提高,发芽1-5d转基因大麦种子α-淀粉酶活性比对照分别增加5.86%、75.24%、118.51%、71.02%和22.99%,β-淀粉酶活性分别比对照增加19.29%、14.68%、35.47%、23.62%和2.67%;种子的发芽能力提高。【结论】TrxS基因能够促进种子发芽。

反义trxs基因对转基因小麦种子内源trxh基因表达的影响

以转反义硫氧还蛋白基因（anti-trxs）株系01TY70-1-17．5及其对照小麦品种‘豫麦70’为试验材料，以小麦中稳定表达的肌动蛋白基因actin为内标，用半定量反转录聚合酶链式反应（semi-QRT．PCR）方法，对转基因株系及其对照种子中trxh基因时空表达情况进行了检测。检测结果表明，花后15～30d转基因株系trxh基因转录量平均比对照下降了20．1％，花后25d显著低于对照（尸．〈0．05）；胚乳trxh基因转录量最低，平均比对照低19.4％；种子吸涨24h时间内，转基因株系trxh基因转录量较对照均略低，但差异不显著。表明，外源trxs基因的导入直接干扰了内源基因的表达。

转反义trxs基因对小麦种子α-淀粉酶活性的影响

通过PCR检测,转基因小麦植株均出现474 bp的目的带,说明反义trxs基因已整合到小麦基因组上。经 测定在种子萌动过程中转基因种子的α-淀粉酶活性低于未转基因种子,证明该基因能够正常表达,从而使转基因品 种具有抗穗发芽的能力。

Anti-trxs和Bar基因共转化小麦后代植株的遗传及表型分析

经对基因枪转化小麦品种皖麦48获得的7株再生苗的PCR、PCR-Southern杂交和除草剂涂抹叶片检测,得到了4株转基因植株,证实了硫氧还蛋白反义基因(Anti-trxs)和抗除草剂Bar基因已经整合到小麦基因组中且能够正常表达。经对T1、T2植株分析表明:Anti-trxs、Bar基因能够稳定的遗传给后代,且普遍呈3∶1的分离,其遗传符合单基因控制的孟德尔遗传规律,部分株系表现1∶1的不正常分离(阳性个体较预期的少),推测这是由于雌或雄配子之一方丢失或外源基因的结构、排列等方面发生了变化的结果。转基因植株的农艺性状与对照相比,T0代有较大变异,但在T2代已得到了回复。

转trxS基因大麦发芽种子水解酶活性的变化(英文)

利用转基因技术是改良大麦品种品质的有效途径。研究了转trxS基因对大麦种子发芽过程中水解酶活性的影响,结果表明转基因种子中α-淀粉酶、自由态β-淀粉酶和极限糊精酶的活性比未转基因种子高;转基因种子醇溶蛋白和谷蛋白中巯基的含量提高,说明该基因能够表达,为大麦育种和品质改良提供新的途径。

反义trxs基因导入对小麦籽粒脱支酶活性的影响

以转反义硫氧还蛋白基因株系01TY34-73-9及其对照品种‘豫麦34’为材料,运用PCR检测和酶活性测定的方法,对转基因株系遗传稳定性以及转基因与对照种子中脱支酶活性进行测定。结果显示:(1)外源基因已经稳定遗传至后代;(2)转基因种子在不同成熟时期和不同萌发过程中的脱支酶活性与对照相比均有不同程度的降低平均降低10.3%,但仅花后25 d到收获后5 d脱支酶活性显著低于对照,其中最低值出现在花后30 d,平均比对照下降了12.0%;(3)在花后30 d和后熟5 d萌发过程中,转基因种子脱支酶活性始终低于对照,平均下降6.2%和22.2%。表明反义trxs基因的导入干扰了小麦trxh基因的表达,使trxh转录量减少,小麦籽粒中脱支酶的活性受抑。

转TrxS基因对啤酒大麦种子贮藏蛋白含量的影响

为探讨导入TrxS基因对大麦籽粒氮代谢的作用,以转TrxS基因啤酒大麦纯合株系为材料,分析了TrxS基因的导入对大麦籽粒蛋白酶活性、醇溶蛋白和谷蛋白含量的影响。结果表明,转基因大麦籽粒的蛋白酶活性增加,发芽第3-5 d转基因大麦种子的蛋白酶活性分别比对照增加42.86%、19.35%和25.76%;发芽第2-4 d醇溶蛋白和谷蛋白的降解平均比对照下降快5.92%和7.10%。

大麦品种资源筛选与TrxS基因的转化利用

对68份大麦种质材料在河南郑州生态条件下进行农艺性状和生态适应性鉴定,从中筛选出适合河南省生态条件的综合农艺性状好的材料31份;利用国家小麦工程技术研究中心获得的转基因大麦新品系,通过有性杂交及回交的方法,将TrxS基因导入41份材料中,经PCR和RT-PCR检测,证明TrxS基因已初步整合进20份材料中,且在部分材料中能够正常表达。本研究获得的材料将为大麦品质育种提供新的种质资源,为分子标记辅助育种提供科学依据。

转反义trxs基因小麦籽粒中ABA和GAs含量与穗发芽的关系

为了揭示反义硫氧还蛋白基因（anti-trxs）在抗穗发芽小麦中的作用机制,探讨转基因小麦籽粒中内源激素ABA和GAs含量变化与穗发芽的关系。以转反义trxs基因两个纯合株系及其未转基因对照小麦品种豫麦18为材料,采用荧光定量RT-PCR、整穗发芽试验和酶联免疫吸附的方法,对小麦灌浆过程中反义trxs基因表达、穗发芽特性及内源激素脱落酸（ABA）和赤霉素（GAs）含量进行了测定。结果表明,在种子形成过程中,反义trxs基因能够正常表达,2个转基因株系中内源trxh基因表达量都明显低于对照;转基因株系籽粒中ABA和ABA/GAs含量显著高于对照,平均分别比对照升高了18.39%和23.47%,而GAs含量在花后15~30天较对照有所降低,平均比对照降低了9.14%;花后20、25、30天,转基因株系的穗粒发芽率显著或极显著低于对照,平均分别比对照下降了49.65%、28.2%、27.23%;相关分析表明,穗发芽率与ABA和ABA/GAs含量均呈显著或极显著负相关,与GAs含量呈正相关。由此推断,反义trxs基因导入抑制了小麦内源同源基因的表达,改变了小麦体内ABA和GAs的平衡,使ABA合成量增加,是导致转基因小麦穗发芽率降低的原因之一。

TrxS基因过表达对大麦种子抗老化能力的影响

为探索TrxS基因对转基因大麦种子耐贮藏能力的影响,以转TrxS基因大麦纯合株系Y002及其非转基因受体(CK1)为材料,采用高温高湿老化处理法,研究了TrxS基因过表达对转基因大麦种子耐贮藏性的影响。结果表明:(1)与非老化处理(CK2)相比,老化处理导致大麦种子发芽率和发芽势显著下降(P<0.05),转基因株系Y002种子发芽率和发芽势的降低速率慢于非转基因种子(CK1),处理3d时Y002种子的发芽势和发芽率分别比CK1高20.00%和22.20%(P<0.05);(2)大麦种子中MDA、羰基含量和相对电导率等氧化损伤指标均随着老化处理时间的延长而增加,转基因株系Y002的上述指标增加率普遍低于CK1,处理3d时Y002的MDA含量、羰基含量和电导率分别比CK1低22.69%、15.02%、17.75%(P<0.05);(3)在老化处理条件下,转基因种子的抗氧化酶活性高于CK1,处理3d时Y002的CAT活性与处理2d的POD活性分别比CK1高23.77%和43.27%(P<0.05)。以上结果说明,TrxS过表达能有效缓解高温高湿处理对大麦种子造成的氧化损伤,增强转基因大麦种子的抗老化能力。

转反义trxs基因小麦分子鉴定及抗穗发芽株系的筛选

为给小麦抗穗发芽育种提供基础材料和参考依据,分别以豫麦18、豫麦70和豫麦34为受体,对转反义trxs基因小麦01TY18、01TY70和01TY34高代株系进行PCR分子检测,并对阳性株系进行离体整穗发芽和α-淀粉酶活性测定。结果表明,经PCR检测T7代40个转基因株系中,阳性株系占55%。与非转基因对照相比,转基因株系的穗粒发芽率和α-淀粉酶活性都有所下降,其中有19个株系穗粒发芽率显著低于对照,占阳性转基因株系的86.4%;有16个株系α-淀粉酶活性较对照显著降低,占阳性转基因株系的72.7%。综合PCR检测、穗粒发芽率和α-淀粉酶活性测定结果,共筛选出转反义trxs基因的抗穗发芽小麦株系15个,其中01TY18 8个、01TY70 5个、01TY34 2个,占所有转基因株系的37.5%、阳性转基因株系的68.2%。

转TrxS基因啤酒大麦的分子检测和农艺性状分析

对不同转TrxS基因啤酒大麦的T1,T2代植株进行分子检测,并根据检测结果对其遗传行为做了分析.结果表明:目的基因在不同材料中的遗传行为不同,TrxS基因在Harrington中符合3∶1的遗传比例,PCR-Southern杂交结果说明目的基因已整合到大麦基因组中,并能够稳定地遗传给后代;而在Franklin后代自交过程中发生丢失而不能稳定遗传.经PCR跟踪检测,得到转基因大麦纯合株系.农艺性状分析结果表明,转基因株系除生育期比对照提前4 d外,其它农艺性状与对照没有明显差异.

转反义trxs基因小麦籽粒发育过程中基因表达差异

为探讨反义trxs基因在转基因抗穗发芽小麦中的作用机制,以转反义trxs基因和非转基因小麦开花后5~30 d的籽粒为材料,采用mRNA差异显示技术分析了转基因与非转基因小麦在籽粒形成过程中的基因表达差异。结果表明,在籽粒发育过程中,转基因与非转基因小麦存在明显的基因表达差异,差异可归纳为转基因增强型、转基因减弱型、转基因特异型和沉默型4种类型,而且特异型表达明显高于增强型和减弱型;差异条带数随种子成熟度的增加而不断增多,到花后第25天达到最高（77条）,然后略有下降,且在胚乳中的差异明显高于胚中的。

过量表达Trxs对H_2O_2胁迫下大麦幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

[目的]分析过量表达Trxs对大麦幼苗叶片抗外源氧化剂胁迫的影响,为分析Trx参与植物抗氧化胁迫机制提供理论依据。[方法]以转Trxs基因大麦株系(LSY-11-1-1)及其非转基因对照株系为试材,研究了在1.5 mmol/L H2O2胁迫条件下,Trxs过量表达对大麦幼苗叶片抗氧化酶活性的影响。[结果]在H2O2胁迫下,转基因大麦的Fv/Fm与Fv/Fo值高于对照,而丙二醛与H2O2含量低于对照;转基因大麦的过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性普遍高于对照;转基因大麦与对照的SOD与GSH-PX活性变化趋势不一致;转基因大麦出现2次活性高峰,而对照仅1次。[结论]过量表达Trxs能够通过增强抗氧化酶活性有效地缓解HO胁迫对转基因大麦幼苗生长所造成的氧化损伤。

转反义trxs基因小麦种子萌发过程中碳代谢的变化

为了揭示反义硫氧还蛋白基因(anti-trxs)在抗穗发芽小麦中的作用机制;以转反义trxs基因小麦株系为材料,运用生理指标分析的方法,对转基因株系和对照种子萌发过程中硫氧还蛋白h活性、淀粉酶活性、可溶性糖和淀粉含量进行了检测;结果表明,转基因小麦籽粒trxh、α-淀粉酶和β-淀粉酶活性均显著低于对照;淀粉降解和可溶性糖生成速率明显下降。发芽1～5d,转基因小麦种子trxh、α-淀粉酶和β-淀粉酶活性分别比对照下降24.5%、40.4%和23.0%;淀粉降解和可溶性糖生成速率分别比对照降低23.7%和23%;说明,反义trxs基因对转基因小麦籽粒的碳代谢有调控作用。