一株大黄鱼虹彩病毒的分离鉴定及多克隆抗体的制备

2021年7月,浙江省象山某养殖场养殖的大黄鱼(Larimichthys crocea)出现类似大黄鱼虹彩病毒引起的疾病。采用鲤上皮瘤细胞培养和病毒主要衣壳蛋白测序分析的方法,从患病的大黄鱼中分离到一株病毒。该病毒接种到鲤上皮瘤细胞(EPC)后出现空斑、脱落的细胞病变症状。根据虹彩病毒MCP和ATPase基因保守序列设计特异性引物对病毒组织样本进行PCR扩增,得到分别为1 367 bp和740 bp的目的基因片段。将MCP基因扩增片段测序,经BLAST对比及系统发育树聚类分析,确定该分离的病毒属虹彩病毒科细胞肿大病毒属。通过蔗糖密度梯度离心纯化,用透射电镜观察该病毒粒子呈正六边形,直径为120~150 nm。用纯化病毒作为抗原免疫小鼠获得抗大黄鱼虹彩病毒的多克隆抗体,效价为1∶7 000;通过SDS-PAGE和Western blotting初步确定3个免疫蛋白。本研究为大黄鱼虹彩病毒纯化提供一种新方法,并初步分离出免疫蛋白,为该病毒相关分子生物学研究、蛋白研究以及疫苗制备等提供理论依据。

特异性抗肝癌单链抗体的优化表达与纯化及其生物学活性鉴定

目的:制备有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体。方法:以ITPG诱导大肠埃希菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体;利用HiTrap抗ETag亲和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化;纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以Bradford检测法测定其浓度,ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性。结果:在培养基中加入0.4mol/L蔗糖,以IPTG1mmol/L于30℃诱导12h,抗肝癌scFv可溶性表达量较多,纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325mg/L,相对分子质量为29×103。与肝癌细胞结合效价为1:64,与肝癌组织结合阳性率为75%,具有良好的生物学活性。结论:成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体,为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础。

抗体分离纯化技术的研究进展

制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败。抗体的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化。重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法。对当前的纯化方法进行了一个简要的综述。

肾上腺素能β1受体亚型特异性抗体的制备及鉴定

【目的】制备和鉴定 β1受体亚型特异性抗体。【方法】人工合成 β1受体细胞膜外第二环 197 2 2 2位氨基酸序列作为抗原。连接钥孔冒贝血蓝蛋白 (KLH)增加抗原性后免疫兔获得抗血清。通过凝胶双扩散实验和ELISA法鉴定其效价 ;通过免疫荧光法及ELISA法鉴定其特异性 ;通过离体蛙心灌流实验鉴定其药理活性。【结果】该抗血清效价高 (分别为 1∶6 4和 1∶10 6)、特异性强 ,能和心肌 β1受体发生特异性结合 (1∶10 4 ～ 1∶10 5) ,为异丙肾上腺素的非竞争性拮抗剂。 (pD2 ′ =1 6 2 )。【结论】成功制备的 β1受体亚型特异性抗体可能成为进一步研究 β1受体分布、功能和定量的有力工具。

大杯伞柄多糖与菌丝体粗多糖的免疫识别方法初探

采用热水(80℃)提取和75%乙醇沉淀、Sepharose CL-4B凝胶过滤及DEAE Sepharose CL-4B阴离子交换等方法分离纯化大杯伞(Clitocybe maxima)柄粗多糖,获得伞柄多糖纯品,制备多糖抗体;采用热水法提取大杯伞菌丝体粗多糖。用碳二亚胺法将纯化伞柄多糖与牛血清白蛋白进行共价化学偶联,并将偶联产物(拟糖蛋白)免疫兔子以制备抗血清,以酶联免疫法检测抗体滴度。依据该抗体与来自相同菌株的菌丝体粗多糖免疫反应差异对这两种多糖进行免疫识别,结果表明:经过亲和层析纯化后,第六次免疫抗血清对伞柄多糖的抗体滴度可达64K,而且对菌丝体粗多糖反应呈阴性,显示该抗体可识别这两种多糖之间的结构差异。

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶因子单克隆抗体的制备

目的：制备从尖吻蝮蛇蛇毒中分离的纤溶因子的单克隆抗体，为克隆基因提供特异性的探针。方法：将纤溶因子免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，取脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，筛选稳定分泌抗体的细胞株。采用血纤维蛋白平板法，观察单克隆抗体能否抑制纤溶因子的纤溶作用。结果：获得２株稳定分泌单克隆抗体的细胞株。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹显示该单克隆抗体能特异地与纤溶因子结合，与其它蛋白无交叉反应，此外，这２株单克隆抗体具有抑制纤溶因子溶解人血纤维蛋白的作用。结论：这２株抗体不仅能特异地与纤溶因子结合，而且具有抑制纤溶的作用，为克隆纤溶因子基因及其功能表达提供了特异性的研究工具。

抗人成骨肉瘤单克隆抗体的制备及其特性

目的 :制备抗人成骨肉瘤单克隆抗体并探讨其特性。方法 :用人骨肉瘤细胞系 OS- 732免疫 BAL B/ c小鼠 ,取其脾细胞与骨髓瘤细胞系 NS- 1融合 ,经酶联免疫吸附试验及补体依赖细胞毒实验筛选 ,获 3株分泌抗人成骨肉瘤单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞。将手术切取经病理证实的骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤、滑膜肉瘤、平滑肌肉瘤、非骨化性纤维瘤、骨软骨瘤和正常肌、骨组织冰冻切片后 ,应用间接免疫荧光抗体实验检测。结果 :3株 Mc Ab均与骨肉瘤组织呈阳性反应 ,其中二株亦与软骨肉瘤呈阳性反应 ,与正常组织及其他肿瘤组织呈阴性反应。 3株 Mc Ab分别与骨肉瘤相关抗原不同的抗原决定簇结合。结论 :抗人成骨肉瘤单克隆抗体具有较高的特异性。

重组人白细胞介素10单克隆抗体的制备

目的 制备重组人白细胞介素 10 (rhIL 10 )单克隆抗体。方法 应用鼠 鼠杂交瘤技术建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系 ,ELISA检测杂交瘤细胞培养上清、腹水效价 ,双向免疫扩散试验进行亚类鉴定 ,Giemsa染色镜下计数杂交瘤染色体数目。结果 获得了 2株能分泌抗rhIL 10单克隆抗体的杂交瘤细胞系 (1D3、2A3) ,无血清培养液效价为 1∶5 12、1∶2 5 6 ,腹水效价 1∶10 5、1∶10 4 。单克隆抗体为IgG2 亚类 ,染色体数目 98～ 10 3条。 2株杂交瘤细胞体外传代培养6个月以上 ,ELISA检测抗体滴度无明显降低。结论 制备的 2株单克隆抗体效价高 。

重组人类神经元14-3-3-zeta信号蛋白的纯化及抗体制备

目的 制备抗人脑 14 3 3zeta蛋白 (31ku)的多克隆抗体与单克隆抗体 ,为神经系统退行性疾病的诊断提供标志物。方法 用纯化的rh14 3 3zeta蛋白免疫家兔 ,制备抗 14 3 3多克隆抗血清 ;电洗脱、透析纯化rh 14 3 3/ β 半乳糖苷酶融合蛋白 ,免疫BALB/c小鼠 ,用杂交瘤技术制备抗rh 14 3 3zeta单克隆抗体 ;测定所得抗体效价及其特异性反应。结果 得到大量纯化的表达产物 ;制备的多克隆抗血清双扩效价达 1∶8～ 1∶6 4 ;获得 1株能稳定分泌抗rh 14 3 3zeta单抗的杂交瘤细胞株 ,其亚型为IgG1型 ,该株单抗可与重组14 3 3蛋白发生特异性反应。结论 获得了敏感、特异的抗rh 14 3 3zeta多克隆抗血清及稳定分泌抗rh 14 3 3zeta单抗的杂交瘤细胞株 ,为神经系统退行性疾病提供诊断标记。

抗Ⅳ型胶原单克隆抗体的制备及其在IgA肾病中的应用

制备了抗Ⅳ型胶原单克隆抗体(McAb),利用 Western blot 法证实 McAb 与Ⅳ型胶原α_1链的120KD、95KD 和60KD 相结合,在 IgA 肾病中Ⅳ型胶原的分布与组织学改变成正相关关系,可以判断 IgA 肾病的病变程度和预后。

用对比分离纯化法论证人血清抗-HBeIgG的异质性

本文通过高、低两组不同的人抗-HBe阳性血清用多种分离IgG的方法,进行了对比分离纯化研究.发现人抗-HBe IgG存在着多种异质性表现.从而提出在单克隆抗-HBe尚未普及前提下应如何挑选人抗-HBe阳性血清以及提取多克隆抗体的最佳方法.

人源抗HBS-Fab-IFN-α融合蛋白制备和纯化

目的:用生物发酵方法大量制备含重组质粒pBAD/HBs-Fab-IFN-α的Topl0大肠杆菌,用金属亲和层析方法纯化大肠杆菌表达产物,获得大量高纯度的人源抗HBS-Fab-IFN-α融合蛋白。方法:选取含重组质粒pBAD/HBs-Fab-IFN-α的Topl0大肠杆菌单克隆菌落,通过制备一级及二级种液,按比例加入5L发酵罐中进行发酵,发酵过程中在菌体起始密度、诱导剂加入时机、诱导时间以及诱导温度等条件探索成熟的基础上,采用50L大型发酵罐进行批量发酵。所获菌体蛋白通过饱和硫酸铵粗提和Ni-NTA金属螯和层析获得较纯的表达产物,比较表达量,鉴定纯化后蛋白的抗原活性及生物学活性。结果:用5L及50L发酵罐能获得较高蛋白产量的大肠杆菌,经饱和硫酸铵粗提及Ni-NTA金属螯和层析纯化后可获得抗原性及生物学活性较好的抗体片段。结论:发酵罐发酵大肠杆菌,产量高,所获蛋白含量活性较稳定,为批量生产作了准备。

双峰驼血清IgG亚型的分离纯化及多克隆抗体的制备

双峰驼IgG亚型包含IgG1、IgG2和IgG3,其中IgG2和IgG3为重链抗体,在结构上与IgG1存在显著差异。为获取双峰驼血清中的IgG1、IgG2和IgG3,并分析其抗原特异性和抗体特异性,本文交替使用Protein A和Protein G亲和层析柱,对其分离纯化,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定;之后分别制备兔抗双峰驼IgG1、IgG2和IgG3的多克隆抗体,通过ELISA对制备的多克隆抗体的效价进行测定;最后应用Western blot评估这3个亚型多克隆抗体的特异性,进而对双峰驼血清中IgG1、IgG2和IgG3的抗原特异性进行分析。结果表明,应用Protein A和Protein G亲和层析柱成功分离纯化出双峰驼血清中的IgG1、IgG2和IgG3;并制备兔抗双峰驼IgG1、IgG2和IgG3的多克隆抗体效价均在1∶10 000以上,且所获得的多克隆抗体分别与IgG1、IgG2和IgG3之间均存在交叉反应,但兔抗双峰驼IgG1多克隆抗体较其它两个亚型多克隆抗体特异性低。结果证明,双峰驼IgG1、IgG2和IgG3均具有良好的免疫原性,三者结构虽存在显著差异,但其抗原特性类似。

角膜内皮抗原及其抗体的提纯

目的 :提纯角膜内皮抗原 (cornealendothelialanti gen ,CEN Ag)及抗角膜内皮抗原抗体 (anti cornealendothelialantibody ,ACEN Ab) ,为角膜移植排斥反应的理论研究提供基础。方法 :用猪角膜内皮做抗原 ,上皮做对照。经离子交换层析及 2B4 .14 .1单克隆抗体亲和层析制得纯化的CEN Ag和角膜上皮抗原 (cornealepithelialantigen ,CEP Ag)。用提纯的CEN Ag和CEP Ag分别免疫家兔 ,取血清经亲和层析得到ACEN Ab和抗角膜上皮抗原抗体 (anti cornealepithelialanti body,ACEP Ab)。结果 :经聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,抗原分子质量分别为 4 3kD和 5 3kD ,相应的免疫球蛋白是IgG2 和IgG3 。结论 :CEN Ag和ACEN Ab可以被提纯并从理论上证明 。

野猪甘露聚糖结合凝集素的分离纯化及其多克隆抗体的制备

对野猪血清样品用溴化氰活化的甘露聚糖结合凝集素-Sepharose4B亲和柱亲和层析,获得纯化的野猪MBL样品,再进行SDS-PAGE电泳,显示有1条32kDa主带,2条36kDa和56kDa副带。选取32kDa的蛋白带制备免疫原,免疫家兔制备抗血清,Western blot方法鉴定该抗体可以特异性识别野猪血清中的MBL分子。本研究表明采用亲和层析法可以获得野猪血清中MBL-A分子,制备的多克隆抗体可以用于检测天然MBL分子,将为野猪MBL的生物学特性及与抗病力相关性的研究提供基础。

大肠癌相关抗原CA－Hb_3的纯化及其在胃肠道肿瘤血清学诊断中的应用

用一株鼠抗人大肠癌单克险抗体Ｈｂ３，纯化后与溴化氰活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联制各免疫吸附柱。用免疫亲和层析法从大肠癌细胞株ＨＲＴ－１８细胞提取液中纯化相应抗原ＣＡ－Ｈｂ３。经多种实验证实ＣＡ－Ｈｂ３是一种新的大肠癌相关糖蛋白抗原、分子量约为６５Ｋｄ．以此纯化抗原作参考标准，用ＳａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ方法检测大肠癌及消化迟其他肿瘤患者血清ＣＡ－Ｈｂ３水平。结果表明，ＣＡ－Ｈｂ３对胃肠运肿瘤诊断的敏感性和特异性较高，具有一定的临床价值。

卵黄抗体技术应用于大规模制备治疗性抗体的研究进展

目前实验室及临床上使用的抗体多数来源于动物血清,不仅产量低成本高,而且在一定程度上有背于动物权益的保护。随着抗体需求量的不断增加,廉价大规模的抗体制备成了新的研究热点。通过免疫禽类(尤其是鸡)将特异性抗体富集于卵黄中来制备具有独特优点的抗体,有望成为能够替代哺乳动物抗体的大规模制备治疗性抗体的有效手段。

抗HIV-1 p15(gag)IgY抗体的制备及活性检测

目的:制备具有高效价强特异性的抗HIV-1 p15(gag)鸡卵黄抗体(IgY),纯化并分析其免疫学活性。方法:用纯化的HIV-1 p15(gag)蛋白抗原免疫蛋鸡,用水稀释法对IgY抗体进行粗提取并结合乙醇沉淀和氯化钠盐析法纯化抗体,再通过SDS-PAGE、Western blot、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体的纯度、特异性及效价。结果:表达纯化的HIV-1 p15(gag)-GST融合蛋白分子量为45kDa,用于抗体检测的抗原。用纯化的His-P15蛋白作为免疫原免疫蛋鸡后,获得的卵黄抗体重链、轻链分子量分别为65kDa和25kDa。8倍体积水稀释卵黄,pH值5.1,20%冰乙醇及0.028mol/L盐溶液分离纯化,纯度可达96℅,每毫升卵黄液可得到的卵黄抗体为9.8mg。终浓度为18%～25%的冰乙醇纯化的抗体浓度高且稳定,同时具有较强的特异性和较高的效价。结论:用HIV-1p15(gag)蛋白免疫蛋鸡,可以获得高效价的特异性抗体IgY,为IgY抗体在HIV-1p15蛋白的研究奠定了实验基础。

外泌体分离与纯化技术研究进展

外泌体是所有真核细胞分泌到细胞外的直径介于30-150 nm的一种膜性纳米囊泡,参与细胞间生物信号的传递。大量实验证据表明,外泌体参与多种生物功能并发挥重要作用,包括蛋白质、RNA和脂质等生物分子的转移及多种疾病生理和病理过程的调节,被认为是疾病诊断、治疗和预后的重要的生物标志物和药物载体,因此发展简单、高效、经济的外泌体分离与纯化技术将有助于疾病的早期诊断和精准治疗。目前,利用外泌体的物理化学和生物化学特性已开发出多种分离外泌体的技术,但仍缺乏标准化和规模化临床级外泌体的分离方法,从而限制了其临床应用。另外,对分离出的外泌体的特征、纯度和数量的鉴定是判断外泌体分离纯化方法优劣的重要指标。本文综述了外泌体分离与纯化技术以及鉴定方法的研究进展,主要讨论分离技术的机制、性能、挑战和前景以及外泌体的鉴定方法,以期为外泌体的分离纯化提供新的思路和解决策略。