凤冈野生天麻抗真菌肽基因(gaf)的克隆与序列分析

为了克隆凤冈野生天麻的抗真菌肽基因(gaf),以凤冈野生天麻的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增抗真菌肽基因(gaf),经克隆和测序结果显示:RT-PCR产物电泳扩增的目标条带长度为545 bp;经测序和序列分析,该基因与Genebank中公布的序列编码天麻抗真菌蛋白的基因序列(AY032588)同源性达97%。此研究成功地克隆了凤冈野生天麻抗真菌肽编码基因。

昆虫抗真菌肽Thanatin基因的合成及原核表达

斑腹刺益蝽 (Podisusmaculiventris)抗真菌肽Thanatin是目前发现的 6种昆虫抗真菌肽之一 ,对真菌具有广谱的免疫诱导杀菌活性 ,由 2 1个氨基酸残基组成 ,对革兰氏阳性和阴性细菌也有一定的杀菌作用。根据已报道的抗真菌肽Thanatin基因的氨基酸序列 ,推导出cDNA序列 ,采用基因片段合成结合PCR扩增的策略 ,获得大量完整的Thanatin基因片段 ,通过T A克隆法克隆至pGEM TEasy载体 ,进行测序 ,结果证实合成的Thanatin基因与预期设计的完全一致。然后将其亚克隆至表达载体pET 2 1d中。经IPTG诱导表达后 ,采用RNA DNA点杂交和RT PCR检测具Thanatin基因插段的RNA转录表达活性 ,初步结果显示该融合表达产物对烟曲霉菌 (Aspergillusfumigatus)和绿色木霉菌 (Trichodermariricle)

白僵菌诱导家蚕抗菌肽enbocin1基因的表达特征及产物的抗真菌活性

家蚕的抗菌肽家族基因enbocin1是蚕体免疫系统相关基因。为解析家蚕对病原真菌感染免疫应答反应的分子机制,采用实时荧光定量PCR检测抗菌肽基因enbocin1在家蚕5龄幼虫感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)后的时空表达模式,结果显示:enbocin1主要在幼虫脂肪体中显著上调表达,而且持续至感染诱导后30 h,感染后8、30 h的表达水平分别上调了约44倍和6倍;在马氏管、体壁中该基因的诱导表达差异不显著,在血淋巴中几乎检测不到该基因的表达。进一步用原核表达系统成功表达并纯化获得了高纯度的重组家蚕抗菌肽enbocin1,体外抑菌试验表明其对白僵菌具有较强的抑菌活性,且重组enbocin1蛋白浓度与抑菌活性之间具有量效关系。用重组enbocin1蛋白制备了效价达1∶30 000的多克隆抗体,可用于进一步深入研究enbocin1的功能及其作用机制。研究结果提示抗菌肽enbocin1在家蚕抵御真菌感染的过程中可能具有重要作用。

贵州野生天麻抗真菌肽基因表达载体的构建

为了构建凤冈野生天麻的抗真菌肽基因(gaf)的表达载体,经BamHI和HindIII酶切的pMD18-T-gaf和pET32a(+)质粒的纯化回收产物并进行连接,连接产物pET32a(+)-gaf转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后,采用菌落PCR、酶切鉴定和阳性质粒测序分析。结果表明:构建的凤冈野生天麻抗真菌肽基因表达载体通过菌落PCR、酶切鉴定和阳性质粒测序分析,目的片段成功插入载体,目的片段与预期的gaf基因大小(545 bp)相符。试验成功构建了贵州野生天麻抗真菌肽基因表达载体,pET32a(+)-gaf可以用来制备抗真菌蛋白。

牛乳铁蛋白十肽的基因改造、克隆及表达

目的克隆并表达牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因。方法参照大肠杆菌偏爱密码子,分别针对牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因,设计并合成两个具有相同黏性末端的DNA片段,同时在其基因前后分别加上天冬酰胺和甘氨酸的密码子,构成羟胺裂解位点,通过连接获得其二拷贝基因同向串联体。分别将该串联体克隆至载体pUC18上,经双酶切、PCR及测序鉴定后,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物纯化后,用凝血酶切割及羟胺裂解。结果获得了牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2二拷贝基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出相对分子质量约29000的目的蛋白条带,纯化后的蛋白经凝血酶切割后,相对分子质量约29000的目的蛋白条带消失。结论已成功克隆并表达了牛乳铁蛋白十肽及其突变体M1和M2基因,为基因工程抗真菌肽的制备奠定了基础。

抗真菌肽CGA-N46基因多顺反子表达载体的构建与鉴定

目的:为提高抗真菌肽CGA-N46表达量,对该基因多顺反子表达进行研究。方法:以pEASY-Blunt为克隆载体,以"pET-30a rbs序列-起始密码子-CGA-N46编码序列-终止密码子"为外源片段,利用同尾酶Nhe I、Spe I和Xba I,构建了含有上述外源片段1、3、5、8拷贝的重组载体pT-CAN46、pT-3CAN46、pT-5CAN46和pT-8CAN46;将pEASY-Blunt上的外源基因片段亚克隆至pET-30a的rbs序列下游,构建了CGA-N46基因1、3、5、8顺反子的重组表达载体pET-CAN46、pET-3CAN46、pET-5CAN46和pET-8CAN46;利用感受态转化法转化大肠杆菌Rosetta,进行了表达研究。结果:在IPTG诱导下,CGA-N46基因1、3、5、8顺反子重组表达载体均能表达CGA-N46单体,各重组表达载体表达CGA-N46的量在总蛋白中的百分含量分别为3.4%、5.0%、12.4%、17.1%。结果表明随着CGA-N46基因顺反子个数的增加,外源蛋白表达量也越来越多。其中,8顺反子表达量最高,实现了CGA-N46的高效表达。结论:多顺反子表达可以克服融合表达和串联表达肽类蛋白的不足;创建的多顺反子表达载体构建方法简化了传统基因工程构建方法的步骤,为基因工程有效提高小肽表达量奠定了基础。