苏紫猪SLA-1基因多态性及其抗病潜能分析

【目的】探究苏紫猪白细胞抗原-1(swine leukocyte antigen-1,SLA-1)基因多态性,并对其抗病潜能进行分析,以期为苏紫猪分子育种提供理论基础。【方法】以苏紫猪血细胞cDNA为模板,用PCR法扩增苏紫猪SLA-1基因并测序,利用DNAStar和Mega 5.0软件分别进行相似性分析及系统进化树构建;利用NetMHCpan 4.1 server分析SLA-1与非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗原表位结合的能力及特征;运用生物学软件对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、结构和功能等进行预测。【结果】试验成功扩增6条苏紫猪SLA-1等位基因序列,分别为SLA-1*sz01、SLA-1*sz02、SLA-1*sz03、SLA-1*sz04、SLA-1*sz05和SLA-1*sz06,其高变异位点主要位于肽结合沟(peptide-binding groove,PBG)α1区和α2区;相似性比对结果显示,6条苏紫猪SLA-1等位基因核苷酸、氨基酸序列相似性分别在92.9%~96.9%、87.0%~94.8%之间,与不同品种猪核苷酸、氨基酸序列相似性分别在92.8%~98.8%、84.3%~98.0%之间;ASFV来源多肽结合能力的预测结果显示,SLA-1*sz01蛋白具有较强的ASFV抗原呈递能力,与ASFV来源B354L蛋白多肽片段FIDKTTVLY具有最高亲和力;SLA-1*sz01蛋白功能域及三级结构预测结果显示,SLA-1*sz01与免疫系统相关,具有经典的SLA-1三级结构。【结论】本研究扩增得到6条苏紫猪SLA-1基因序列,其中SLA-1*sz01能够限制性结合较多的ASFV来源抗原表位多肽,与多肽片段FIDKTTVLY具有最高亲和力,可作为苏紫猪抗病育种的候选基因。研究结果为ASFV疫苗的研发提供参考基础。

昆明地区HBsAg与抗-HBs双阳性慢性HBV感染患者流行病学调查及PreS/S基因突变特征

目的探讨昆明地区HBsAg与抗-HBs(Anti-HBs)双阳性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者流行病学及PreS/S基因突变特征。方法选择2018年5月—2022年4月于云南大学附属医院住院及门诊定量检测乙肝两对半的438例慢性HBV感染患者为观察对象,将202例HBsAg(+)/抗-HBs(+)患者作为观察组,将236例HBsAg(+)/抗-HBs(-)患者作为对照组,对比两组患者临床特征。使用巢式聚合酶链反应扩增出PreS/S基因全长序列,确定基因型并分析PreS/S基因突变特征。结果观察组患者在<10岁及高于80岁人群中的流行率较高,而对照组在20~49岁人群中的流行率较高。与对照组比较,观察组患者年龄、HBsAg<250 IU/mL比例、C型HBV感染及乙肝携带者比例均显著增加(P<0.05)。成功扩增PreS/S并测序成功的观察组样本共132例,其中B型基因81例,C型基因51例;对照组样本中B型基因110例,C型基因65例。B型基因患者中,与对照组比较,观察组N末端区域突变率明显增加(P<0.05)。C型基因患者中,与对照组比较,观察组MHR、a决定簇及N末端区域突变率明显增加(P<0.05)。在观察组中,81例B型基因患者中PreS基因缺失突变14例(17.28%),51例C型基因患者中PreS基因缺失突变19例(37.25%),而在对照组中未发现PreS基因缺失突变。结论HBsAg/抗-HBs双阳性HBV感染者在<10岁及高于80岁HBsAg阳性人群多见,HBsAg/抗-HBs双阳性可能与HBsAg突变及PreS基因突变有关。

隐匿性HBV感染患者HBVS基因N-糖基化突变对HBsAg抗原性影响的分析

目的分析隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV S基因主要亲水区(MHR)N-糖基化突变的抗原性,探讨N-糖基化突变与OBI发生机制的关系及临床意义。方法选取2例OBI患者血清中检出的4种NXT/S形式突变,其中sQ129N为已知经典的N-糖基化突变,其余3种为本课题组新发现的突变,采用前期构建成功的野生型及突变型S基因重组质粒转染HepG2和Huh7细胞,验证3种新型突变形式,并分析4种突变对HBsAg抗原性的影响及这些突变地6种HBsAg检测试剂的反应性。结果 Western blotting结果证实3种新型突变均为N-糖基化突变。激光共聚焦结果显示,与野生株相比,4种突变株HBsAg/His标签的荧光强度比值分别降低了76.3%、53.4%、67.1%和52.7%,双抗体夹心法得出结果类似。用6种HBsAg临床试剂进行的检测结果显示,与野生株相比,3种新型突变株对6种HBsAg试剂的反应性均明显降低(P<0.05);其中携带双N-糖基化突变(aa113-118 TSTTST→NST+aa131-133 TSM→NST)的HBsAg抗原性降低最为明显,导致测试的6种试剂中4种无法检测到该突变蛋白。结论 HBV S基因MHR区N-糖基化突变抗原性降低是引起患者OBI表现的主要原因之一,目前临床常用的HBsAg检测试剂对突变抗原的检测敏感性仍需要进一步提高。

HBsAg和抗HBs双阳性患者S基因新增N-糖基化突变的意义

目的分析乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg+抗HBs双阳性患者S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变的特点,探讨HBsAg+抗HBs双阳性的发生机制和临床意义。方法对284例HBsAg+抗HBs双阳性和314例HBsAg单阳性的慢性HBV感染者S基因进行测序分析。对1例携有MHR区双N-糖基化新型突变株的慢性乙肝患者样本进行随访收集和研究。构建双N-糖基化突变和对照前S/S基因重组质粒,转染HepG2细胞,分析突变对病毒复制力和抗原性的影响。结果 HBsAg+抗HBs双阳性患者MHR区新增N-糖基化突变的检出率为11.3%(32/284),显著高于HBsAg单阳性患者的2.9%(9/314)(P<0.01)。HBsAg+抗HBs双阳性组中,72例肝细胞癌(HCC)在N-糖基化突变阳性和阴性患者中所占比例分别为46.9%(15/32)和22.6%(57/252)(P<0.01)。从1例患者中检出的新型株突变形式为s116-118TST→NST+s131-133TSM→NST,并联合sP120缺失+G145D突变,在3份随访样本中该突变株分别占98.0%、2.0%和2.5%,第2份样本中检出s130-132GTS→NSS单N-糖基化突变株,占17.6%,但无s P120缺失+G145D联合突变。与野生株相比,新型突变株复制力提高31%,但HBsAg定量降低99%。免疫荧光结果显示,双N-糖基化定点回复突变株可部分恢复HBsAg检出水平,提示除双N-糖基化突变外,sP120缺失+G145D联合突变对HBsAg抗原性减弱也有明显影响。结论 HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HBsAg+抗HBs双阳性相关,两者同时出现可能是HCC发生的高风险因素;S基因MHR区新增双N-糖基化+sP120缺失+sG145D联合突变共同影响HBsAg的抗原性。

日本血吸虫中国大陆株28kDa GST基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌ＴＢ１中表达合日本血吸虫中国大陆株２８ｋＤｅ抗原基因的重组质粒，表达产物是融 合蛋白，分子量为３３ｋＤａ。采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱纯化表达产物。２、４－二硝基氯苯／谷胱 甘肽分光光度测定法和琼脂糖－淀粉凝胶电泳显示重组抗原具有较高的谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ） 活力。酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）结果表明该重组抗原可检测到重组２８ｋＤａ ＧＳＴ或日本血吸虫 虫体ＧＳＴ免疫绵羊血清中的特异性抗体；免疫印迹试验（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析揭示重组抗原的 ３３ｋＤａ抗原分子能被这两种免疫血清识别，证明它具有ＧＳＴ抗原性。

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。

HBV感染者血清HBsAg、抗-HBs共存与S基因变异

目的 :探讨无锡地区HBV感染者HBsAg与抗 -HBs的共存模式与S基因变异、病毒复制及免疫治疗的关系。方法 :采用Abbott及ELISA测定HBVM ;套式PCR检测HBVDNA并作序列分析 ;荧光定量法检测HBVDNA含量。结果 :30例adr亚型 ,1例adw亚型 ;2 1份血清出现S区多部位变异 ,造成HBsAg肽 36、47、6 3、77、89、90、115、12 6、12 9、139、15 4位氨基酸替换 ;该变异不影响病毒复制 ;变异组免疫药物的使用率 6 6 .6 % ;抗 -HBs阳性血清加入HBsAg阳性血清后 ,再测抗 -HBs阴转。结论 :S基因变异导致HBsAg抗原性的改变和与抗 -HBs结合力的降低 ,以及检测灵敏度的提高、亚型的转变都是造成HBsAg与抗 -HBs共存的原因 ;

HBsAg和HBsAb双阳性检测结果的初步分析

目的对临床检测中少见的HBsAg和HBsAb双阳性结果进行分析,寻找可能的产生原因。方法对3家医院初筛HBsAg和HBsAb双阳性的81份血标本进行同种和不同种试剂盒复检,并检测HBsAg145位氨基酸变异(G145R变异)、HBV DNA基因型和血清型分析。结果81份双阳性标本经复检有30例(37%)仍然为双阳性;对30例复检双阳性标本应用不同试剂盒再次检测,HBsAg/HBsAb仍为双阳性者18例(22.2%);18例双阳性标本G145R检测全部为阴性;其中8例HBV DNA阳性血清的基因型分布为B型2例和C型6例,血清型分布为adw 2例、adr 5例和ayr 1例,与9份对照血清的检测结果比无显著性差异。结论HBsAg和HBsAb双阳性检测结果大多数与操作或试剂的质量有关,少数可能为S基因变异或不同血清型的再次感染等有关。

HBsAg及抗-HBs同时阳性患者血清中HBV-S基因分析

目的分析HBsAg以及抗-HBs同时阳性血清中HBV-S基因的变异情况。方法对广州市部分中学生体检中发现的HBsAg以及抗-HBs均为阳性的血清提取乙肝病毒DNA,针对S基因进行巢式PCR扩增,将产物进行序列分析并比较结果。结果测序结果与Genbank中的序列比较,均发现S基因某些位点发生变异。结论HBsAg以及抗-HBs同时阳性的产生可能与HBV-S基因的变异有关。

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

研究目的对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。方法参考GenBank上公布的TGEVS基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoRI和XholI对表达载体PET-32a(+)和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a(+)多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。结果所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因A抗原位点的原核表达载体。结论TGEVS基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。

HBsAg+/HBsAb+慢性乙型肝炎患者S区基因突变分析

目的研究乙肝表面抗原(HBsAg)+/乙肝表面抗体(HBsAb)+慢性乙型肝炎(CHB)患者S区基因突变情况。方法选取2012年6月～2017年10月首都医科大学附属北京佑安医院(以下简称"我院")HBsAg和HBsAb双阳性的CHB患者32例为研究对象(HBsAg+/HBsAb+组),随机选取在同一时期我院诊断为HBsAg+和HBsAb-的CHB患者79例作为对照(HBsAg+/HBsAb-组)。分离其血浆病毒DNA,PCR扩增S区基因,测序分析其突变情况。结果 HBsAg+/HBsAb+组患者全部存在S区突变(100%),其频率显著高于HBsAg+/HBsAb-组(84.81%)(P <0.05),而且突变多集中在S区亚单位1和3区域;HBsAg+/HBsAb+组S区多重位点突变的比例显著高于HBsAg+/HBsAb-组(P <0.01)。结论 S区基因突变频率的增加以及多重突变的存在与CHB患者S抗原抗体的变化密切相关,而这一突变的累积预示着不良的疾病进程。

HBsAg和抗-HBs双阳性患者乙肝病毒S区及RT区变异研究

目的探索HBs Ag和抗-HBs双阳性患者乙肝病毒S区及RT区基因变异情况。方法采用ELISA法筛选HBs Ag阳性病例,运用化学发光法进一步确认。采集研究对象血清,应用商品化离心柱法行HBV DNA提取。HBV S区和RT区变异状况采用PCR扩增后双向测序获得。采用SPSS17.0软件进行结果分析。结果实验组(HBs Ag和抗-HBs双阳性患者)HBs Ag氨基酸变异率为2.95%,对照组(HBs Ag单阳性患者)为1.80%,2组有显著差异(P=0.019)。HBs Ag N末端氨基酸变异率在实验组为3.37%,对照组为1.85%,2组有显著差异(P=0.047)。虽然HBs Ag MHR区在2组也存在显著差异(P=0.009),但这种差异可能由于该片段α决定簇第1茎环区氨基酸变异所致,因第1茎环区变异率在实验组和对照组分别为11.90%和1.79%,有显著差异(P=0.002)。实验组α决定簇特异性变异位点为I126V、A128V、Q129H、M133I、F134L,而对照组为G145E/R。实验组RT区氨基酸变异率为2.86%,对照组为2.35%,2组无显著差异(P=0.229)。结论 HBV S区MHR的α决定簇第1茎环区氨基酸高变异率可能是HBs Ag和抗-HBs双阳的原因之一,但研究结论尚需进一步验证。

HBsAg阴性/HBV DNA阳性与S基因变异的关系——附8例报告

目的研究无锡地区HBV感染者HBsAg缺失与S基因变异的关系,探讨其形成机理。方法采用ABBOTT测定 HBV M;套式 PCR检测 HBV DNA并作S基因序列分析;荧光定量法测定HBV DNA含量。结果8例HBsAg缺失者S基因出现了变异,导致HBsAg肽63、82、89、90、91、101、115、154位氨基酸替换,且89、90位氨基酸为联合变异;该模式75％(6/8)系慢性肝炎病人,87.5％(7/8)未使用免疫制剂,其HBV DNA含量是低的,而血清抗-HBs中位数值达239.1mU/ml。结论 HBsAg缺失模式多为自然发生的变异,变异主要发生在 a决定簇以外部分,可改变HBsAg的抗原性,使其不能被现行的试剂所检出,此外HBsAg阴性也与血液中HBV DNA含量低有关。

基于重测序的民猪与大白猪SLAⅠ类基因多态性及抗病潜能差异分析

不同中外猪种对疾病的抵抗能力有一定差异,原因之一是不同猪种猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)分子的多样性不同。本研究旨在探究中外猪种的SLA基因差异,为阐明地方猪的抗病机理提供重要参考。本研究首先对健康的8头民猪以及4头大白猪进行基因组重测序,并对所获得的SNP进一步质控用于后续分析。使用VCFtools、GEVALT软件分析SLAⅠ类基因的SNP以及单倍型,并将SNP利用ENSEMBL中的VEP工具进行注释,在全局层面阐述两个猪种的SLAⅠ类基因多样性。通过Mega软件比对两猪种的经典SLAⅠ类基因外显子2和3的核苷酸及编码氨基酸序列,利用Expasy服务器上的ProtParam工具和Protscale程序分析蛋白质特性,并利用DnaSP软件计算核苷酸多样性,分析两个猪种经典SLAⅠ类基因抗原递呈能力的差异。结果表明,民猪的SLAⅠ类基因具有更多的SNPs和长度较短的单倍型块,并且错义突变的碱基数量较多。在经典SLAⅠ类基因的外显子2和3可分别鉴定出2个等位基因,民猪在等位基因上的核苷酸多样性要明显高于大白猪,并且民猪具有更多的碱基突变以及位于抗原结合位点上的氨基酸突变。两个猪种的经典SLAⅠ类基因氨基酸表现为亲水性,民猪的亲水性要强于大白猪。综上所述,SLAⅠ类基因在民猪上有更强的多态性。民猪经典SLAⅠ类基因的碱基突变数量和抗原结合位点上氨基酸突变的数量都要多于大白猪。本研究所检测到的民猪在经典SLAⅠ类基因ARSs上的变异可为猪抗病育种标记的筛选提供参考。

深圳地区HBsAg和HBsAb同时阳性者HBVS基因检测与分析

目的 了解乙肝病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）和乙肝病毒表面抗体（HBsAb）同时阳性者HBV-DNA水平及其S区是否变异的情况.方法 采用ELISA方法,从2011年7月～2012年10月间测定乙肝血清学标志物的1 690例门诊和住院患者中,筛选出HBsAg和HBsAb同时阳性者10例.采用荧光定量PCR法检测HBV-DNA水平,采用聚合酶链反应（PCR）、基因克隆和测序的方法,对HBsAg和HBsAb同时阳性者的HBV S基因进行分析,并与HBV参考序列S基因进行比较,分析其变异情况.结果 10份HBsAg和HBsAb同时阳性者血清,经HBV-DNA荧光定量PCR检测和S基因PCR扩增,2份为HBV-DNA阳性,均为B基因型.其S基因序列与参考序列（JX429908.1）相比,同源性分别为99.64%和99.46%,一份在第161位由酪氨酸变为苯丙氨酸（Y→F）,另一份在第21位由亮氨酸变为丝氨酸（L→S）,第184位缬氨酸变为谷氨酸（V→E）.结论 HBsAg和HBsAb同时阳性者在＂α＂决定簇以外存在点突变,改变了HBsAg的结构和抗原性,影响了HBsAg与抗-HBs的结合能力.

前S1抗原检测阴性的HBV感染孕妇血清学和前S1基因特征分析

目的 分析前S1抗原(Pre-S1Ag)检测阴性的HBV感染孕妇血清学特征和前S1基因测序结果,为正确解释HBV感染孕妇中Pre-S1Ag检测无反应性和预防HBV垂直传播提供依据。方法 以2021年7月—2022年12月山东省妇幼保健院健康检查的孕妇为研究对象,检测乙肝五项和Pre-S1Ag,选取乙肝表面抗原(HBsAg)阳性而Pre-S1Ag阴性的标本为实验组共14例,随机选取HBsAg和Pre-S1Ag均阳性的标本为对照组20例,进行HBVDNA定量检测,并扩增PreS/S基因和测序。结果 HBV感染孕妇中Pre-S1Ag阴性仅在HBsAg、抗-HBe、抗-HBc三者均阳性的乙肝五项血清学模式中发现,占比4.17%,其他HBV感染血清学检测模式中未发现;实验组和对照组HBeAg、抗-HBe阳性率均存在显著差异(P <0.001);实验组与对照组比较,HBsAg检测结果分别为(29±91)IU/mL和(2070.6±714.8)IU/mL,HBV DNA定量结果分别为:(1.63±0.05)lgIU/mL和(5.79±1.53) lgIU/mL,差异均有统计学意义(P <0.001);测序结果显示:对照组中有3例B基因型,17例C基因型;实验组14例标本均为C基因型;两组前S1蛋白变异率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV感染孕妇中Pre-S1Ag无反应性与PreS基因变异并无相关性,而是与HBV DNA载量低导致Pre-S1Ag表达水平低于检测限有关。不能忽视Pre-S1Ag检测阴性的HBV感染孕妇发生垂直传播的可能性。

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在毕赤酵母中的表达

采用基因重组的方法构建了含有猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris分泌型表达载体pPIC9K-ts,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达外源蛋白的毕赤酵母工程菌株GS115/pPIC9K-ts。表达蛋白经Dot-ELISA检测具有良好的抗原性。本研究为TGE的血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。

猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间片段的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间的目的片段经克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导重组菌株表达其融合蛋白。结果显示,目的片段的大小为357bp,序列分析表明,S基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测表明,分子质量约34ku的融合蛋白具有良好的反应原性。

乙肝表面抗原小蛋白S基因导入番茄的遗传转化体系的建立

以丽春番茄无菌苗的子叶为外植体,以农杆菌菌株EHA105(包含质粒pBin438S)为载体,将乙肝表面抗原小蛋白S基因导入番茄组织中.基本培养基采用MS+6-BA1 0mg/L+IAA0 2mg/L,在共培养时加入乙酰香酮100μmol/L作为诱导剂,经过组织培养得到转基因植株.对转化植株基因组进行的分子学PCR检测表明,外源基因有可能已整合到番茄基因组中.该转基因遗传体系的建立为利用转基因植物生产乙肝口服疫苗奠定了基础.

科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿AP2基因部分片段克隆及其抗原性预测

【目的】克隆分析科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿AP2基因片段,为深入研究奶牛乳腺炎无乳链球菌免疫机制及制备新型免疫抗原提供理论依据。【方法】根据Gen Bank已公布牛源无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿的AP2基因序列,采用Primer 5.0软件设计1对特异性引物,以内蒙古通辽地区乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板,扩增AP2基因片段,并分析其编码序列及免疫活性。【结果】科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿AP2基因片段大小为699 bp,共编码233个氨基酸残基,其基因序列与Gen Bank已公布牛源无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿AP2基因序列(EU930008)的相似性达99.6%,仅有3个碱基出现变异(402C→A、563C→T和467A→T)。菌毛岛屿辅助蛋白AP2二级结构的α螺旋在C端分布较多;β折叠较丰富,且分布均匀;而无规则卷曲分布在两端。菌毛岛屿辅助蛋白AP2的亲水区分布较广,几乎遍布于整个蛋白区,属于亲水性蛋白;其抗原指数较高的区段较丰富,抗原性良好;蛋白质分子表面可及性也较高,其区域占比达54.0%。【结论】科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿AP2基因具有高度保守性,其编码蛋白具有良好的抗原性,可作为阻止无乳链球菌感染的候选疫苗靶标抗原。