抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定

为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。

黄芪、穿心莲单独或与抗菌肽LL-37联合应用对铜绿假单胞菌生物膜的影响

【目的】探讨黄芪、穿心莲对铜绿假单胞菌(PA)生物膜的抑制作用及与抗菌肽LL-37联合应用是否有协同作用。【方法】培养铜绿假单胞菌野生菌株PAO1生物膜,并采用紫外分光光度法进行鉴定。采用微量肉汤稀释法分别检测黄芪、穿心莲和抗菌肽LL-37对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)。采用紫外分光光度法检测20、50、100 g/L黄芪,20、50、100 g/L穿心莲单独用药或分别与32、64μg/mL抗菌肽LL-37联合应用对PAO1生物膜的作用。【结果】成功构建体外PAO1生物膜模型。黄芪、穿心莲在3.125～200 g/L浓度范围内对PAO1无抑制作用。抗菌肽LL-37对PAO1的MIC为256μg/mL。黄芪、穿心莲单独用药对PAO1生物膜早期形成均具有抑制作用(P<0.05),呈现浓度依赖性。黄芪/穿心莲与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1生物膜的形成及对成熟生物膜的清除作用不明显,不具有协同作用。【结论】黄芪、穿心莲均能够早期抑制PAO1生物膜的形成并且在一定程度上对成熟生物膜结构有一定的破坏作用;与抗菌肽LL-37联合应用时,不具有协同作用。

人源抗菌肽LL-37

LL 3 7是迄今在人体中发现的抗菌肽cathelicidin家族中的唯一成员 ,也是人体内唯一的双亲性α螺旋结构的抗菌肽 .LL 3 7在人体的血液细胞和上皮细胞中广泛分布 ,具有广谱抗菌作用 .抗菌活性依赖其螺旋构象的形成 ,通过“地毯样”机制杀灭细菌 .LL 3 7有中和内毒素的作用 ,能与LPS和CD14结合 ,中和LPS的生物活性 ,还能利用formylpeptidereceptor like 1(FPRL1)作为受体介导趋化作用 ,招募免疫细胞到感染部位 ,清除病原物 .很多感染性疾病都与LL 3 7低表达或功能失活有关 .LL 3 7是一种多功能的抗菌肽 。

葡萄糖对水性可降解聚氨酯装载抗菌肽LL-37抑制体外尿源性ESBLs大肠埃希菌生物膜形成的影响

目的:探讨葡萄糖浓度变化对水性可降解聚氨酯(biodegradable waterborne polyurethane,BWPU)装载人源抗菌肽LL-37体外抑制ESBLs大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)生物膜活性的影响。方法:采用尿源性ESBLs E.coli临床株(E44)为实验株,E.coli标准菌株ATCC25922(E0)做质控。构建胱细菌生物膜动态孵育模拟系统。"两步法"制备新型LDI-BWPU乳液PCLPU33。"物理溶解和常温干燥法"制备LDI-BWPU装载不同LL-37浓度的载肽膜。设立4个实验分组:H组:高肽组(LL-37,2 000μg/m L)、L组:低肽组(LL-37,250μg/m L)、P组:阳性对照(亚胺培南,8μg/m L)、N组:阴性对照(无抗菌药),持续感染人工尿液环境下孵育48 h,观察不同葡萄糖浓度(0、11.1、33.3 mmol/L)及控制葡萄糖浓度(33.3→0 mmol/L)对载肽膜抑制生物膜的影响。检测方法包括:生物膜细菌活菌计数;Syto-9/PI荧光染色结合激光共聚焦显微镜构建立体图测量生物膜厚度;扫描电镜观察生物膜结构的细微观。生物膜细菌活菌计数和生物膜厚度的多组间均数比较采用单因素方差分析,α=0.01。结果:基于胱细菌生物膜动态孵育模拟系统,在持续感染人工尿液环境下不同葡萄糖浓度观测点,P、H、L组生物膜活菌计数和厚度均明显低于N组(~aP=0.000)。H组生物膜活菌计数在无糖环境(G0 mmol/L)明显低于L组(b P=0.000),在含糖环境下(G11.1,33.3 mmol/L)与L组差异无统计学意义(P>0.01);H组生物膜厚度在不同葡萄糖观测点均明显低于L组(~bP=0.000)。与无糖环境(G0 mmol/L)相比,含糖环境(G11.1,33.3 mmol/L)H、L组生物膜活菌计数和生物膜厚度均明显增加(~cP=0.000)。调控葡萄糖浓度后(33.3→0mmol/L),H、L组BF细菌活菌计数和生物膜厚度均明显降低(~dP=0.000)。结论:持续感染人工尿液环境下不同葡萄糖浓度时,载肽膜通过抑制生物膜生长、杀灭生物膜细菌明显抑制细菌生物膜形成。

LL-37对COPD模型大鼠Th17/Treg平衡及炎症反应的调节作用

目的观察人源抗菌肽LL-37对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡、炎症反应的影响,并探讨可能机制。方法40只Wistar大鼠随机分为正常组、COPD组、LL-37组、LL-37联合DAPT(Notch1/Jagged1信号通路抑制剂)组。正常组室温下正常喂养,COPD组、LL-37组、LL-37联合DAPT组采用烟熏法建立COPD模型。LL-37组大鼠经鼻滴入LL-37(10μg)50μL,LL-37联合DAPT组大鼠经鼻滴入总体积50μL的LL-37(10μg)+DAPT(10μg)。正常组、COPD组大鼠分别经鼻滴入等体积的生理盐水。检测外周血Th17、Treg细胞占比;检测肺泡灌洗液(BALF)中白介素-8(IL-8)、白三烯B4(LTB4)含量;HE染色检测气道重塑指标;Western Blot法检测肺组织Notch1、Jagged1、发状分裂相关增强子1(Hes1)蛋白表达量。结果与COPD组比较,LL-37组外周血Th17占比和Th17/Treg、BALF中IL-8、LTB4含量、管壁厚度/外径(MT%)及管壁面积/气管总面积(MA%)均降低,Treg占比升高(P<0.05);与LL-37组比较,LL-37联合DAPT组外周血Th17占比和Th17/Treg、BALF中IL-8、LTB4含量、MT%及MA%均升高,Treg占比降低(P<0.05)。与COPD组比较,LL-37组Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表达量升高(P<0.05);与LL-37组比较,LL-37联合DAPT组Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表达量降低(P<0.05)。结论人源抗菌肽LL-37可调节COPD大鼠外周血Th17/Treg失衡,抑制炎症反应及气道重塑,激活Notch1/Jagged1信号通路可能是其发挥治疗作用的机制之一。

寻常性银屑病患者皮损中抗菌肽LL-37和人β防御素-2mRNA的表达

目的:探讨寻常性银屑病患者皮损中抗菌肽LL-37与人β防御素-2(hBD-2)mRNA的表达。方法:应用逆转录(RT)-PCR方法检测31例寻常性银屑病患者皮损和16例正常人皮肤组织中LL-37和hBD-2mRNA的表达。结果:与正常人皮肤组织相比,寻常性银屑病患者皮损中LL-37和hBD-2mRNA的表达水平明显升高(P<0.001)。结论:寻常性银屑病患者皮损中LL-37和hBD-2mRNA表达水平的上调可能与银屑病患者很少发生皮肤感染等有关。

5′-非转录区序列改建提高毕赤酵母表达抗菌肽LL-37

目的:探讨5′-非转录区(5′-UTR)序列改建对毕赤酵母表达外源蛋白LL-37的影响。方法:去除毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9 5′-UTR内GGATCCAA序列,转化E.coli DH5α,构建改良的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9-EDIT;PCR鉴定及测序确认后与酵母偏爱密码子编码的LL-37基因片段连接,构建改良的重组表达载体pPIC9-EDIT-LL-37;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定后诱导LL-37表达,筛选最佳表达条件,对表达产物进行凝胶电泳和Western印迹分析;比较转入pPIC9-EDIT-LL-37及pPIC9-LL-37后毕赤酵母表达产物的抑菌活性,间接测定改建前后LL-37蛋白表达量的变化。结果:PCR鉴定及测序证实pPIC9-EDIT改建成功,成功构建重组载体pPIC9-EDIT-LL-37;转化毕赤酵母后表达产物PCR鉴定出LL-37基因,最佳诱导甲醇浓度为0.5%,最佳诱导表达时间为72h,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37;改建后LL-37蛋白表达量提高了约35倍。结论:pPIC9 5′-UTR序列的改建能明显提高毕赤酵母表达LL-37蛋白,值得进一步研究以应用于其他外源蛋白表达。

人源抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达

目的构建人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞MCF-7中进行表达。方法以重组质粒pcDNA4.0-LL-37为模板,采用PCR法扩增LL-37/hCAP-18基因,连入pEGFP-c1质粒,构建真核表达载体pEGFP-c1-LL-37,瞬时转染人乳腺癌细胞MCF-7,采用激光共聚焦显微镜观察重组质粒的转染效率,RT-PCR法检测目的基因的表达。结果所构建的抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体经双酶切和测序证明构建正确,在瞬时转染MCF-7细胞48h后,目的基因转染效率较高,约为40%,RT-PCR结果显示,重组质粒转染的细胞可扩增出339bp的目的基因条带。结论已成功构建了人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞中获得表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。

铜绿假单胞菌痰培养阳性患者抗菌肽LL-37、CRP水平变化及临床意义

目的探讨铜绿假单胞菌痰培养阳性患者的抗菌肽LL-37和C反应蛋白(CRP)水平变化情况及相互关系。方法选取广东省中医院2016年9月至2017年5月收治的铜绿假单胞菌痰培养阳性患者50例、健康体检27例作为研究对象,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法检测抗菌肽LL-37水平,免疫比浊法检测CRP水平。结果铜绿假单胞菌痰培养阳性患者组的抗菌肽LL-37和CRP水平均显著高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05),两者呈正相关(r=0.411,P<0.05)。结论铜绿假单胞菌痰培养阳性时,抗菌肽LL-37和CRP水平升高,对评估患者感染的早期诊断有一定临床应用价值。

补充维生素D3治疗对成人支气管扩张症患者肺功能、LCQ评分、抗菌肽LL-37和IL-8水平的影响

目的探讨补充维生素D3治疗对成人支气管扩张症患者肺功能、生命质量、抗菌肽LL-37和IL-8水平的影响。方法选择2016年2月至2017年2月在我院住院治疗的支气管扩张症且血清25(OH)D≤30 ng/mL的患者97例,随机分为观察组49例和对照组48例。对照组患者均给予支气管扩张症常规治疗,观察组患者在对照组治疗的基础上补充维生素D3治疗,800 IU/d,连续治疗观察6个月。比较两组患者治疗前后的肺功能,莱塞斯特咳嗽生命质量问卷(LCQ)评分,血清25(OH)D、抗菌肽LL-37和IL-8水平。结果治疗前后,两组患者的FVC、FEV1%水平比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗6个月后,观察组患者LCQ评分明显提高且显著高于对照组(P<0.05);观察组患者的血清25(OH)D、LL-37水平明显升高且显著高于对照组,血清IL-8水平明显降低且显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者血清25(OH)D变化值与血清LL-37变化值呈弱正相关(r=0.662,P=0.001)。结论补充维生素D3治疗,可提高支气管扩张症患者血清25(OH)D水平,但不能明显改善其肺功能;可减少促炎介质的产生;随着血25(OH)D水平的升高,可以上调抗菌肽LL-37的表达,增强免疫应答反应,有助于患者防御病原微生物和促炎性细胞因子的攻击。

抗菌肽LL-37在动脉粥样硬化中的研究

抗菌肽LL-37是目前在人体中发现的cathelicidins家族的惟一成员,结构上它不含有半胱氨酸,无链内二硫键,为具有α-螺旋结构的两性分子;生物特性上,它不仅具有广泛的抗菌活性,抗病毒活性,而且具有免疫调节作用——在动脉粥样硬化斑块形成过程中,介导血管平滑肌细胞的凋亡。撰文就LL-37的组织分布、分子结构和生物学特性及其在动脉粥样硬化过程中作用的研究进展予以综述。

抗菌肽LL-37和维生素D受体在呼吸机相关性肺损伤大鼠肺组织中的表达及作用机制

目的探讨抗菌肽LL-37和维生素D受体(VDR)在呼吸机相关性肺损伤(VILI)大鼠肺组织表达及作用机制。方法30只洁净级SD大鼠(雌雄各半)随机分为自主呼吸组,正常潮气量组(VT=6 ml/kg)和大潮气量组(VT=40 ml/kg),每组10只,雌雄各半,3组大鼠经腹腔注射麻醉后行气管切开插管术。其中自主呼吸组保持大鼠自主呼吸,正常潮气量组按6 ml/kg给予机械通气,大潮气量组按40 ml/kg给予机械通气,4 h后经心脏穿刺放血,处死大鼠。采用精密电子秤称量肺湿干比重(W/D),HE染色观察肺形态变化,透射电镜观察Ⅱ型肺泡超微结构,ELISA检测血清和BALF中的白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、髓过氧化物酶(MPO)和人巨噬细胞炎性蛋白2(MIP2)促炎因子的水平,Western-blot检测肺组织中抗菌肽LL-37和维生素D受体蛋白表达。结果大潮气量组W/D明显高于自主呼吸组和正常潮气量组(P<0.05),而正常潮气量组W/D明显高于自主呼吸组(P<0.05);HE染色结果显示大潮气量组有明显的水肿、肺间质变宽,且肺泡充血,同时伴随有大量的炎性细胞浸润,肺泡组织紊乱,大潮气量组病理评分明显高于自主呼吸组和正常潮气量组(P<0.05),而正常潮气量组病理评分明显高于自主呼吸组(P<0.05);大潮气量组AT-Ⅱ细胞的细胞膜、细胞质以及细胞核与自主呼吸组和正常潮气量组相比出现明显改变,细胞膜微绒毛随着潮气量增大而减少,薄膜增厚,细胞质中的板层小体数量减少,分布不均,细胞核形态不一,出现固缩;大潮气量组血清和BALF中IL-6、TNF-α、MPO和MIP2明显高于自主呼吸组和正常潮气量组(P<0.05),而正常潮气量组血清和BALF中IL-6、TNF-α、MPO和MIP2明显高于自主呼吸组(P<0.05);大潮气量组LL-37和VDR明显低于自主呼吸组和正常潮气量组(P<0.05),而正常潮气量组LL-37和VDR明显低于自主呼吸组(P<0.05)。结论机械通气引起的肺损伤会导致抗菌肽LL-37和维生素D受体表达下调,免疫功能紊乱,从而介导或者加重VILI。

hCAP-18/LL-37全长肽真核表达产物对树突状细胞分化成熟的影响

目的研究人源阳离子抗菌肽(hCAP)-18/LL-37全长肽真核表达产物对树突状细胞分化成熟的影响。方法将已构建的hCAP-18/LL-37全长肽真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18转染Hela细胞株,在转染后48 h收获培养上清;人外周血单个核细胞分离,体外定向诱导分化成树突状细胞(DC);将转染后收获的培养上清与体外培养的DC共同孵育,48 h收获DC,经流式细胞仪检测DC表面分子CD83、CD86、CD40及HLA-DR的表达。结果FCM结果显示:pcDNA4/Myc-His-hCAP-18转染Hela细胞培养上清与pcDNA4/Myc-His空载体转染细胞培养上清相比较,均可上调DC表面分子CD86、CD40及HLA-DR的表达。结论构建的hCAP-18/LL-37全长肽真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18转染Hela细胞株培养上清液均可上调DC表面分子CD86、CD40及HLA-DR的表达,促进DC的分化成熟。

尖锐湿疣皮损中人β防御素(HDB)-2,3及LL-37的表达

目的:检测尖锐湿疣患者皮损中抗菌肽HBD-2、HBD-3及LL-37 mRNA的表达。方法:应用逆转录(RT-PCR)方法检测56例尖锐湿疣患者皮损和30名正常人皮肤组织中HBD-2、HBD-3及LL-37 mRNA的表达。结果:与正常人皮肤组织相比,尖锐湿疣患者皮损中HBD-2、HBD-3及LL-37 mRNA的表达水平明显升高(P<0.05)。结论:尖锐湿疣患者皮损中HBD-2、HBD-3及LL-37mRNA表达水平的上调可能与尖锐湿疣患者局部产生免疫防御有关。

抗菌肽LL-37与皮肤病的相关性研究

抗微生物肽LL-37在先天性免疫防御中发挥重要作用,因其具有多种生物学活性,在免疫性疾病和感染疾病方面的研究成为热点。近年研究提示,LL-37可能通过影响巨噬细胞、中性粒细胞、免疫等功能而参与多种皮肤病的病理生理过程。LL-37及其衍生物在多种皮肤病的临床应用也有广阔的研究前景。本文就LL-37的功能、LL-37与常见皮肤病的关系等研究进展作一综述。

抗菌肽LL-37与胃肠道疾病的研究进展

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是机体天然免疫的重要组成部分.内源性抗菌肽cathelicidins为存在于哺乳动物中的一类抗菌肽,而LL-37是目前发现的唯一一类存在于人体的cathelicidins家族抗菌肽,也在抗炎、抗肿瘤及组织修复等方面发挥着重要的调控作用.越来越多的研究表明LL-37与多种消化系疾病有关,其在消化系疾病诊断和治疗中的应用也日益受到关注.本文就LL-37的结构、生物学活性、与消化系疾病的关系及研究进展作一综述.

LL-37抗菌肽及其与牙周病的关系

牙周病是一种微生物感染导致的牙周组织炎症破坏性疾病,先天性免疫防御功能正常与否与牙周炎的发展转归息息相关。组织蛋白酶抑制素cathelicidin是一种内源性抗菌肽,人源阳离子抗菌肽(hCAP)-18和LL-37是迄今发现的唯一的cathelicidin家族成员,而前者是其前体形式,后者则是其有活性的成熟形式。本文就hCAP-18和LL-37,LL-37的功能,LL-37与牙周病的关系等研究进展作一综述。

人cathelicidin抗菌肽LL-37在宿主防御系统中的作用

存在于哺乳动物中的一类抗菌肽cathelicidin由上皮细胞产生,LL-37为目前在人体内仅发现的一种cathelicidin。同防御素一样,LL-37为人免疫防御系统的重要组成部分,除了具有广谱抗菌活性外,还有免疫调节、诱导血管生成、抗内毒素、促进损伤修复、诱导细胞凋亡等生物学功能。本文综述LL-37的表达分布、生物学活性及其作用机制。

人源抗菌肽LL-37真核表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

【目的】使人源抗菌肽LL-37在真核表达载体中获得高效表达.【方法】采用RT-PCR技术,从人的血样中扩增出LL-37基因片段,并将其连接至pcDNA3.1-His-V5(+)载体.通过脂质体介导法将重组质粒转入奶牛乳腺上皮细胞,G418筛选获得稳定阳性细胞株,并且利用RT-PCR和Western-blot检测目的基因在转录及翻译水平的表达情况.【结果】RT-PCR结果显示,经转染的乳腺上皮细胞能够扩增出523bp的LL-37基因.qRT-PCR结果发现,LL-37mRNA在转染后的不同时期均有表达,经稳定转染的表达量最高.通过Western-blot检测,获得了约17kU的目的蛋白.【结论】结果表明,LL-37基因成功整合至奶牛乳腺上皮细胞并能够正确表达,这为构建分泌LL-37蛋白的奶牛乳腺生物反应器提供了依据.

检测结核性胸膜炎患者抗菌肽药物Cathelicidin hCAP18/LL-37浓度的临床价值

目的探讨抗菌肽药物(Cathelicidin hCAP18/LL-37)检测在结核性胸膜炎患者中的临床意义。方法测定58例结核患者和30例非结核胸膜炎患者血浆及胸腔积液中hCAP18/LL-37、腺苷脱氨酶(ADA)水平,并以32例健康体检者血浆中hCAP18/LL-37和ADA的水平作为对照分析。结果结核患者与非结核胸膜炎患者血浆中的LL-37水平,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);结核患者与非结核胸膜炎患者血浆中ADA的浓度水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);结核患者与非结核胸膜炎患者血浆中的LL-37水平、ADA水平之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结核患者胸腔积液LL-37水平低于非结核胸膜炎患者,胸腔积液ADA浓度高于非结核胸膜炎患者,两组之间差异有统计学意义(P<0.05);LL-37与ADA呈负相关。结论检测结核性胸膜炎患者胸腔积液和血浆中LL-37的水平及其分布变化,可为结核性胸膜炎临床诊断,提供一定的实验依据。