恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)基因在毕赤酵母系统中的高效表达

目的 利用毕赤酵母高效表达系统表达用于下游实验的恶性疟原虫AMA - 1(Ⅲ )重组蛋白。方法 将测序正确的AMA - 1(Ⅲ )基因插入毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9k中 ,用高压电穿孔转化法将目的基因转化入酵母感受态细胞GS115 ,筛选高拷贝转化子 ,利用甲醇进行诱导表达。表达产物用SDS -PAGE和免疫印迹进行检测。结果 AMA - 1(Ⅲ )蛋白表达于培养上清 ,蛋白的相对分子质量分别为 16 .3ku ,免疫印迹结果表明AMA - 1(Ⅲ )基因表达蛋白能被抗AMA - 1(Ⅲ )的单抗所识别 ,出现特异条带 ,推算AMA - 1(Ⅲ )蛋白的表达量为 0 .8g/L。 结论 酵母细胞表达系统可高效表达在构象方面接近天然蛋白的AMA - 1(Ⅲ )

恶性疟原虫海南株AMA-1、Pfs230基因的序列分析

目的 测定恶性疟原虫海南 (FCC1/HN)株裂殖子顶端膜抗原 1(AMA - 1)基因和Pfs2 30基因序列 ,并分别进行序列分析。方法 根据AMA - 1基因已知序列合成一对引物 ,用PCR技术从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中扩增AMA - 1基因 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3 -AMA - 1。根据Pfs2 30基因已知序列合成七对引物 ,分 7段从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pfs2 30基因 ,并分别将扩增片段插入pMD - 18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定克隆的AMA -1、Pfs2 30基因序列 ,应用DNAstar软件辅助进行序列分析和同源性比较。结果 PCR扩增得到恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1和Pfs2 30基因片段。恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1基因全长 186 9bp ,无内含子 ,编码 6 2 2个氨基酸残基 ,不存在氨基酸重复序列 ,相对分子量约 72 0 4 5kDa ;Pfs2 30基因全长 94 35bp ,无内含子 ,编码 314 4个氨基酸残基 ,分子量为36 4 36kDa。恶性疟原虫FCC1/HN株与FC2 7、7G8、CAMP、FCR3、Thai -Tn、3D7、FVO、KF1916、CMP1、HB3、K1和V1株AMA - 1的同源性在 94 9%以上 ,各株间有 5 3个位置相同的氨基酸残基替代位点 ,并且发生替代的氨基酸残基具二态性。FCC1/HN株分别比 3D7、7G8株Pfs2 30抗原多 9、10个氨基酸残基 ,三个分离株有 2 8个氨基酸替换?

细胞因子表达质粒对恶性疟原虫顶端膜抗原1DNA免疫的调节作用

目的 探讨细胞因子表达质粒对小鼠DNA免疫的促进和调节作用。 方法 构建编码恶性疟原虫顶端膜抗原 1(AMA1)完整胞外域的DNA免疫质粒VR10 2 0 /E ,构建编码小鼠细胞因子 (GM CSF)、白细胞介素 (IL)如IL 4和IL 12的真核表达质粒pcDNA3 /GM CSF、pcDNA3 .1( ) /IL 4和pIL 12以及双顺反子质粒pGM CSF/pTPA E ,分组免疫小鼠 ,ELISA检测血清中特异性IgG及其亚类的水平 ,取小鼠脾细胞进行体外增殖。 结果 3种细胞因子质粒均有效增强了小鼠针对VR10 2 0 /E的免疫应答 ,抗体水平增加 7至 10倍 ,其中pcDNA3 /GM CSF质粒和pIL 12质粒分别显著促进了小鼠的IgG1和IgG2a应答 ,小鼠脾细胞的体外增殖水平亦有明显提高。 结论 利用编码GM CSF、IL 4和IL 12的表达质粒作为佐剂可有效增强小鼠针对AMA1DNA的免疫应答 ,并对免疫应答的类型产生调节作用。

恶性疟原虫顶端膜抗原-1(P.f AMA1)基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

本文采用PCR方法自P .f基因组中扩增了编码AMA 1完整胞外域及其相应结构域的基因片段 ,定向克隆入原核表达载体pET 16b和pET 30a (+) ,经测序确证后将重组子转入BL2 1(DE3)进行诱导表达 ,用SDS PAGE鉴定 ,对可溶性和包涵体形式的重组蛋白分别采用天然状态和变性状态下的Ni离子亲和层析进行纯化 ,变性蛋白再在GSH GSSG氧化还原条件下经透析重新折叠复性。所得纯化产物为进行有关AMA

以恶性疟原虫MSP1和AMA1疫苗组合免疫小鼠诱导保护性免疫

目的以MSP1和AMA1的DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗组合免疫小鼠,诱导针对疟疾红内期抗原MSP1和AMA1的保护性抗体。方法将编码恶性疟原虫MSP1全片段和AMA1胞外域的DNA免疫质粒(VR1020/190.3和VR1020/E)、痘苗病毒载体(rMVA/190.3和rMVA/E)及重组蛋白(d-GX190H和E)的同种类型疫苗混合,作为核酸疫苗(D)、病毒疫苗(V)及蛋白疫苗(P)按照“初始-强化”策略免疫小鼠。间接ELISA测血清中抗MSP1和AMA1抗体;用免疫血清进行体外原虫入侵红细胞抑制实验;由转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19和P.bANKA株分别对免疫鼠进行体内攻击。结果各组免疫血清中均产生了较强的抗体应答,抗MSP1抗体与抗AMA1抗体滴度的变化趋势一致。实验组免疫小鼠血清在体外对两株原虫入侵红细胞均有较大程度的抑制。体内攻击实验中实验组小鼠平均存活时间较对照组略长。结论采用以MSP1和AMA1为基础的DNA、重组痘苗病毒和重组蛋白疫苗的组合免疫小鼠能诱导出有效的保护性抗体。以上结果为疟疾红内期疫苗合理免疫方案提供了重要的实验依据。

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立

目的建立恶性疟原虫顶端膜抗原1(AMA-1)基因转染伯氏疟原虫的模型.方法将含有恶性疟原虫AMA-1基因的重组转染质粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.用BglI酶切线性化.伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化,转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测.结果PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA-1基因.结论成功建立了恶性疟原虫AMA-1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础.

重组表达的恶性疟原虫顶端膜抗原1片段诱导小鼠保护性抗体应答

目的 分析恶性疟原虫顶端膜抗原(apical membrane antigen 1,AMA1)主要结构域在诱导保护性抗体应答中的作用,为正确选择疫苗应用片段提供依据。方法 PCR扩增编码P.fAMA1相应结构域的基因序列,构建pET原核表达载体,用纯化重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA测定抗体效价,用免疫荧光和免疫印迹分析抗体的特异性,用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑制实验。结果 成功表达并纯化了代表AMA1不同结构域的重组抗原片段,包括完整的胞外域片段E、结构域Ⅰ+Ⅱ、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,免疫小鼠后分别诱导出不同滴度的IgG抗体,免疫血清可特异地识别天然AMA1抗原,重组蛋白E和Ⅰ+Ⅱ免疫血清可明显抑制疟原虫的体外生长。结论 AMA1胞外结构域的完整性是构成保护性抗体表位的重要基础,保护性抗体表位主要分布在结构域Ⅰ中。

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因多态性分析

目的研究不同地理分离株恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原1(Pf AMA-1)基因的多态性。方法采集2006-2012年福建省23例输入性恶性疟患者的血样,以血样中的疟原虫DNA为模板,巢式PCR扩增AMA-1基因片段,利用生物软件进行序列比对分析。结果 23份血样均扩增出目的条带(约505 bp),发现32个多态位点,共计18个单倍型,其中8个为新报道序列。来自非洲的恶性疟原虫分离株的AMA-1基因序列具有较丰富的遗传多样性[单倍型多样度(Hd)=0.985,核苷酸多样度(π)=0.0258],亚洲(东南亚和中国云南)的遗传多样性相对较低(Hd=0.909,π=0.0221)。多样化选择分析结果显示,非同义突变率与同义突变率差值(d N-d S)为0.031±0.006,中性检验结果均无统计学意义(P>0.05)。基因内重组分析显示,重组事件的最低数量(Rm)为10,连锁不平衡指数R2随核苷酸遗传距离增加呈明显下降趋势。采用邻接法构建的分子系统树显示,所有分离株分为3个群(G1,G2和G3),G1多为非洲分离株,G3大部分为亚洲分离株。结论来自非洲的恶性疟原虫分离株的AMA-1基因序列具有较丰富的遗传多样性。

吉布森巴贝虫顶膜抗原-1基因的表达及表达产物的生物学活性

通过免疫筛选法,从构建的犬吉布森巴贝虫cDNA基因表达文库中筛选到1个cDNA克隆,此cDNA核苷酸全长2 108 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码蛋白的分子质量约为62 ku。经过分析,此蛋白(BgAMA-1)与其他巴贝虫属的顶膜抗原-1具有较高的同源性。为了研究其生物学活性,以此cDNA为模板,利用PCR扩增BgAMA-1的全基因,并将其克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了原核表达载体pGEX-4T-3/BgAMA-1。通过Western-blotting对表达并纯化的重组蛋白的生物学活性进行分析。结果显示,构建的pGEX-4T-3/BgAMA-1能在大肠杆菌DH5α中表达,所获的重组抗原BgAMA-1在Western-blotting上仅与吉布森巴贝虫感染犬血清发生反应,证实其具有种特异性,在诊断方面可能有一定的应用价值。

伯氏疟原虫顶端膜抗原1胞外区及其亚区的表达与免疫保护作用分析

目的表达伯氏疟原虫顶端膜抗原1(PbAMA-1)胞外区E及其各亚区,分析其免疫原性和免疫保护作用。方法抽提伯氏疟原虫基因组,对PbAMA-1基因测序,依据该序列采用毕赤酵母密码子使用频率重新设计PbA-MA-1基因序列。将其胞外区E分为3个彼此重叠的基因片段DⅠ、DⅡ和DⅢ并进行优化,人工合成后在大肠埃希菌中诱导表达。表达产物经纯化和重折叠,分别与福氏佐剂乳化后免疫小鼠和家兔,均免疫3次,间隔2周。每次免疫剂量,小鼠为20$g,家兔为100$g。ELISA检测抗体效价,并以疟原虫攻击实验确定各抗原的免疫保护效果。结果测得的PbAMA-1基因序列与Sanger测序中心公布的序列完全一致。密码子优化并人工合成的DⅠ、DⅡ、DⅢ和E目的基因片段在大肠埃希菌表达载体pET32a均获得诱导表达,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,各目的基因表达产物大小与预计的相对分子质量Mr 44 300、Mr 33 300、Mr 29 900和Mr 67 200相一致。表达产物经镍离子螯合柱(Ni-NTA柱)纯化和谷胱甘肽(GSH)氧化还原法体外重折叠,蛋白纯度达90%以上,各纯化的重组蛋白在小鼠体内均激发产生高滴度抗体。其中,完整的胞外区E第3次免疫后抗体滴度为(34.4±0.15)×10-4,与其他组相比,免疫原性较其他各亚区更强(t=5.66,P<0.01;t=2.27,P<0.05和t=5.05,P<0.01)。取家兔免疫血清与感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠血膜抗原片进行间接荧光抗体试验(IFAT),均为阳性,其中抗E的抗血清免疫荧光强度最高,与ELISA检测的抗体水平一致。取家兔抗血清对小鼠伯氏疟原虫粗提抗原进行蛋白质印迹(Western blot)分析,产生特异性反应条带,表明能够识别天然的PbAMA-1蛋白。免疫小鼠在以伯氏疟原虫攻击实验中得到部分保护,DⅠ、DⅡ、DⅢ和E各免疫组小鼠与佐剂对照组相比,存活时间明显延长(t=2.78,P<0.05;t=2.67,P<0.05;t=3.46,P<0.01和t=3.50,P<0.01)。结论人工合成的PbAMA-1具有良好的免疫原性和免疫保护作用,完整的胞外区E较其各亚区表现出更好的免疫原性。

恶性疟原虫AMA1不同类型疫苗组合免疫接种研究

目的探索应用恶性疟原虫DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种,诱导针对恶性疟原虫红内期抗原AMA1的保护性抗体。方法PCR扩增云南株恶性疟原虫AMA1编码基因,构建和制备DNA免疫质粒VR1020/E(疫苗D)、重组改良安卡拉痘苗病毒rMVAPE(疫苗V)和重组原核表达AMA1胞外域蛋白E(疫苗P)。用疫苗D单独或与小鼠GM2CSF表达质粒共同对小鼠进行初始免疫,用疫苗V和疫苗P进行单次或先后各一次追加强化。采用疫苗D2V组合方案免疫新西兰白兔。ELISA测定小鼠血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a的水平,用免疫动物血清进行疟原虫裂殖子体外入侵抑制实验。结果在疫苗D初始免疫的基础上,采用疫苗V或疫苗P进行强化免疫可显著提高小鼠针对AMA1的抗体应答,小鼠血清特异性IgG平均增加15至137倍,GM2CSF表达质粒对疫苗D2V组合免疫小鼠的抗体应答有显著促进作用。采用疫苗D2V组合免疫在家兔可诱导明显的抗体应答。小鼠和家兔免疫血清在体外可显著抑制疟原虫裂殖子对RBC的入侵。结论将DNA疫苗、重组改良安卡拉痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种是诱导疟疾红内期保护性抗体的有效方法。

携带恶性疟原虫ama1基因的重组MVA构建及免疫性分析

目的 构建稳定表达恶性疟原虫 (Pf)顶端膜抗原 1(AMA1)的重组改良安卡拉痘苗病毒 (MVA) ,对其诱导小鼠免疫应答的特性进行分析。方法 构建包含PfAMA1编码基因的重组载体pⅢdHR .ssp E ,转染MVA感染的BHK2 1细胞 ,经同源重组插入MVA基因组的deletionⅢ位点 ,利用宿主范围基因k1l在RK13细胞中对rMVA进行瞬时筛选 ,用获得的rMVA E(K1L)感染BHK2 1并进行传代 ,经内部同源重组去除k1l后获得rMVA E。采用PCR、IFA和Westernblot对rMVA E的基因组序列和重组抗原的表达情况进行鉴定。用不同剂量的rMVA E经腹腔接种免疫BALB c小鼠 ,ELISA检测特异性抗体应答的水平并分析IgG亚类 (IgG1和IgG2a) ,取脾细胞用重组抗原在体外进行刺激增殖。结果 获得了可稳定表达PfAMA1的重组MVA ,经 3次腹腔接种不同剂量 (10 7～ 10 8TCID50 )后的rM VA E诱导BALB c小鼠产生了水平相当 (P >0 .1)的抗AMA1抗体 ,其IgG亚类以IgG2a为主 ,各免疫组脾细胞在体外对AMA1抗原的再刺激均产生了明显的回忆应答。结论 成功构建了携带Pfama1基因的重组MVA。rMVA E可诱导小鼠产生AMA1特异的免疫应答。

间日疟原虫顶端膜抗原1基因多态性分析

目的研究不同地理株间日疟原虫(Pv)裂殖子顶端膜抗原1(AMA-1)基因多态性。方法采集镜检确诊的间日疟患者滤纸血3滴,煮沸法提取滤纸血中pv DNA,套式PCR扩增包含PvAMA-1Ⅱ区(793bp)DNA片段,扩增产物经电泳鉴定后纯化并测序,利用生物软件进行序列比对分析。结果 17例患者感染的间日疟原虫分为9种单倍型,只有1种(V3)在基因库中未发现100%吻合的序列;含9个多态位点(s=9),核苷酸多样度(π)为0.00859±0.00093,非同义突变率与同义突变率差值(dN-dS)为-0.00230±0.00539,但Z检验差异无统计学意义(P>0.05)。中性检验差异均无统计学意义(P>0.05)。重组事件的最低数量(Rm)为2,在整个411bp序列中R2随着核苷酸遗传距离增加呈下降趋势不明显。结论间日疟原虫顶端膜抗原1(AMA-1)Ⅱ区基因序列遗传多样性程度较低。

弓形虫重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18的构建及鉴定

目的构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18 DNA重组质粒,并对其进行克隆及鉴定。方法采用PCR法对目的基因进行扩增,构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,转染至人包皮成纤维细胞(HFF)进行表达并用SDS-PAGE和β-actin进行鉴定。结果经测序、双酶切和PCR鉴定,重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18构建正确;经RT-PCR和SDS-PAGE鉴定,AMA1、ROP18基因均在哺乳动物细胞中正确转录与表达。结论成功构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,并可在HFF细胞中稳定表达。

柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与微线蛋白-2相互作用的鉴定

目的研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间的相互作用。方法以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增EtAMA1和EtMIC2基因,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-EtAMA1及捕获载体pGADT7-EtMIC2并转化Y2HGold酵母菌中,观察酵母在营养缺陷选择培养基上的生长情况。原核表达GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白,纯化后进行GST-Pulldown试验。同时构建真核表达载体pcDNA3.1-HisEtAMA1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2并转染HEK-293T细胞,收集细胞裂解液,进行免疫共沉淀试验。在此基础上构建双分子荧光互补载体pEtAMA1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151并转染HEK-293T细胞,激光共聚焦观察转染细胞荧光发生情况。结果诱饵基因和捕获基因均对酵母双杂交系统无自激活和毒性作用,pGBKT7-EtAMA1/pGADT7-EtMIC2共转化菌能激活酵母双杂交报告系统;原核表达并纯化GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白进行GST-Pulldown试验,二者可在体外相互作用;EtAMA1和EtMIC2可在HEK-293T细胞中共表达,免疫共沉淀试验进一步证实二者间的相互作用;双分子荧光互补技术验证EtAMA1和EtMIC2在细胞内存在相互作用。结论通过酵母双杂交、GST-Pulldown、免疫共沉淀及双分子荧光互补技术验证柔嫩艾美耳球虫顶膜抗-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间存在相互作用,这为揭示微线蛋白在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的分子机制提供了理论基础。

我国云南、海南恶性疟原虫顶端膜抗原1基因结构域Ⅲ多态性分析

目的 分析中国云南、海南两省恶性疟原虫顶端膜抗原1（apical membrane antigen 1,AMA-1）（Ⅲ）多态性.方法 收集海南、云南感染恶性疟原虫患者的血液187份,提取血样基因组DNA.设计两对引物扩增AMA-1（Ⅲ）基因,将PCR产物进行测序,分析其单倍型多样性.结果 187份样品中的AMA-1（Ⅲ）基因有23种单倍型,云南株有21种,海南株7种,海南有2种单倍型未在云南株中发现,云南株单倍型多样性高于海南株.AMA-1（Ⅲ）基因有9个多态位点,云南株有3份样品451位氨基酸残基的同义突变,云南、海南这些位点每种突变出现的比例不同.结论 恶性疟原虫AMA-1（Ⅲ）基因多态性在云南、海南两省各有其特点,对此结构域的群体遗传多样性分析可为针对此区域疟疾疫苗的设计提供有价值的信息.