牛磺酸对大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤时细胞凋亡的影响

目的:从细胞凋亡的角度探讨肢体缺血再灌注(LIR)后急性肺损伤(ALI)的发病机制及牛磺酸的影响。方法:复制大鼠肢体缺血再灌注(LIR)损伤动物模型,采用TUNEL法、电泳法、半定量逆转录聚合酶链反应(SqRT-PCR)及免疫组织化学等技术观察LIR后肺损伤发生过程中,肺泡上皮及血管内皮细胞凋亡变化以及Fas/FasL系统蛋白质和mRNA表达的改变。结果:大鼠LIR后,肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞凋亡明显增加;肺组织Fas/FasL mRNA和蛋白质表达明显上调,DNA断链率、组织钙含量和活性氧(ROS)升高,且与肺泡上皮及血管内皮细胞凋亡的增加相一致。结论:肺泡上皮及血管内皮细胞凋亡以及Fas/FasL系统表达明显上调可能参与LIR后ALI的发生;牛磺酸可减少肺组织细胞凋亡,但并非通过影响Fas/FasL基因表达而实现其保护效应。

PKCε信号通路介导的葛根素抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用

目的探讨葛根素(puerarin,Pue)抗心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤保护作用与PKCε蛋白表达的关系。方法培养新生SD大鼠原代心肌细胞,分为正常对照(Con)组、A/R组、葛根素+A/R(Pue+A/R)组、葛根素+抑制剂+A/R(Pue+εV1-2+A/R)组、抑制剂+A/R(εV1-2+A/R)组。Western blot测定PKCε蛋白表达水平,MTT法检测细胞存活率,比色法测定培养液肌酸磷酸酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞内丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,流式细胞仪测定线粒体膜电位和细胞凋亡。结果葛根素预处理24h后,心肌细胞PKCε表达呈剂量依赖性上调(P<0.01);培养液CPK、LDH活性降低,细胞内SOD、GSH-Px活性升高,MDA含量减少,细胞存活率升高,细胞凋亡减少(P<0.01);PKCε抑制剂εV1-2则可明显消弱葛根素的上述心肌保护作用。结论葛根素的抗心肌缺血/再灌注损伤保护作用涉及PKCε信号通路,至少部分依赖于其对PKCε表达水平的上调。

红花多糖对人胃癌SGC-7901细胞线粒体膜电位及增殖的影响

目的体外观察红花多糖(SPS)对人胃癌SGC-7901细胞线粒体膜电位(MMP)及细胞增殖的影响,初步探讨SPS对SGC-7901细胞的抑制机制。方法不同浓度的SPS处理SGC-7901细胞,倒置显微镜观察SGC-7901细胞的形态学变化,透射电镜观察SGC-7901细胞超微形态结构变化,罗丹明123染色观察SGC-7901细胞MMP变化,MTT比色法检测SGC-7901细胞的增殖。结果倒置显微镜观察到经SPS处理的贴壁细胞体积变小,部分细胞崩解,有凋亡小体形成,随剂量增加愈加明显;透射电镜观察到经SPS处理的细胞线粒体肿胀、胞核浓缩偏移,呈凋亡形态改变;罗丹明123染色可见经SPS处理的细胞内荧光强度显著下降,该作用呈明显的时间依赖性;MTT检测显示经SPS处理的细胞体外增殖受抑制,该作用呈明显的剂量依赖性。结论 SPS可以降低人胃癌SGC-7901细胞MMP,同时能明显抑制SGC-7901细胞体外增殖并可诱导细胞凋亡,该作用呈一定的时间与剂量依赖。

大鼠肢体缺血再灌注后肺组织BAX基因表达上调

目的探讨在体大鼠肢体缺血再灌注(LIR)后肺组织BAX和BCL2基因表达的变化。方法在大鼠肢体缺血再灌注(LIR)损伤动物模型上,用TUNEL法、电泳法及免疫组织化学等技术观察LIR后肺损伤发生过程中,肺组织细胞凋亡变化以及BAX和BCL2蛋白质表达的改变。结果大鼠LIR后,肺血管内皮细胞及附壁的炎细胞凋亡明显增加;肺组织BCL2表达的变化不大,但BAX蛋白质表达明显上调,DNA断链率升高,活性氧(ROS)含量增加,且与肺组织细胞凋亡的增加相一致。结论肺组织细胞凋亡以及BAX和BCL2表达的变化可能参与LIR后肺损伤的发生。

内毒素性肝衰竭大鼠TLR4mRNA表达、血清肿瘤坏死因子-α及肝细胞凋亡的动态变化

目的观察急性内毒素性肝衰竭大鼠肝组织中TLR4mRNA表达变化规律及其与血清肿瘤坏死因子-α水平、肝细胞凋亡的关系。方法雌性Wistar大鼠给予D-氨基半乳糖/脂多糖同时腹腔注射,计算动物死亡率及生存时间,动态观察给药后4、8、12h肝功能、血清肿瘤坏死因子-α、肝组织TLR4mRNA表达及病理变化,以TUNEL法检测原位细胞凋亡,计算凋亡指数。结果80%大鼠死于急性肝衰竭,平均生存时间15.6h±1.8h,病理表现为肝脏大块或亚大块坏死。给药后4、8、12h血清TNF-α增高含量及肝细胞凋亡均增加,血清TNF-α变化早于肝细胞凋亡指数的增加,肝组织TLR4mRNA的表达与血清TNF-α含量呈正相关(r=0.709,P=0.000)。结论内毒素通过单核吞噬系统TLR4介导TNF-α大量产生,激活炎症级联反应并诱导肝细胞凋亡是内毒素性肝衰竭的重要病理机制之一,阻断肝内外单核吞噬系统TLR4介导的的生理学作用,可能会对内毒素性肝衰竭起到一定防治作用。

体外诱导大鼠脂肪源间充质干细胞成肌腱潜能的研究

目的体外诱导脂肪源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AT-MSCs)成肌腱细胞,为临床肌腱损伤的修复提供理论基础。方法从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离出脂肪源间充质干细胞,经生长分化因子-5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导,使其向肌腱细胞分化。应用形态观察和RT-PCR等方法,从形态和分子水平上对诱导分化的细胞进行鉴定。结果从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离出的AT-MSCs呈散在分布,排列不规则,以星形和多角形细胞为主,能稳定增殖传代。经5、10 ng/mL GDF-5诱导8 d后,大部分细胞呈梭形。RT-PCR结果显示经GDF-5诱导的细胞,Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达明显高于未经诱导的对照组;GDF-5诱导的细胞Bcl-2/Bax均高于对照组。结论从脂肪组织中可以获得具有多向分化能力的AT-MSCs,并能在体外稳定传代。经GDF-5诱导后,AT-MSCs有向肌腱细胞分化的倾向。GDF-5在一定时间内对细胞凋亡有抑制作用,有利于AT-MSCs向肌腱细胞的分化。AT-MSCs有可能替代骨髓间充质干细胞作为组织工程学的种子细胞,用于肌腱损伤的修复。

抗凋亡蛋白表达与晚期乳腺癌紫杉醇化疗敏感性的关系

目的:探讨抗凋亡蛋白Survivin在乳腺癌组织中的表达及其与晚期乳腺癌紫杉醇化疗敏感性的关系。方法:应用免疫组化方法,对40例应用紫杉醇化疗的乳腺癌患者癌组织中Survivin表达水平进行检测,分析其与紫杉醇化疗敏感性的关系。结果:乳腺癌患者Survivin表达阳性率为60·0%(24/40);紫杉醇化疗后,有效组(CR+PR)患者Survivin阳性率为40·9%(9/22),无效组(NC+PD)患者Survivin阳性率为83·3%(15/18),两者之间差异有统计学意义,χ2=7·424,P=0·006。结论:Survivin表达水平与乳腺癌对紫杉醇化疗敏感性呈负相关,Survivin可能作为一项筛选乳腺癌化疗药物、指导制定合理治疗方案的新指标。

肝X受体激动剂GW3965对高糖所致心肌细胞凋亡的影响及作用机制

目的:观察GW3965对高糖诱导的心肌细胞凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法:取对数期H9c2心肌细胞,随机分为对照组(Control组)、高糖诱导组(高糖组)和高糖诱导+激动剂处理组(GW3965组)。GW3965组细胞加入10μmol/L GW3965预处理24h,之后高糖组和GW3965组细胞加入33mmol/L葡萄糖继续诱导培养24h。采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1荧光染料法检测线粒体膜电位,Western blot检测LXRα、ERK和p38 MAPK信号通路相关蛋白的变化。结果:GW3965可以提高H9c2抑制细胞凋亡,提高细胞存活率,改善细胞线粒体膜电位变化,并抑制ERK和p38 MAPK通路活性。结论:GW3965通过介导LXRα和MAPK通路减轻高糖诱导的细胞凋亡和线粒体损伤,对心肌细胞具有保护作用。

肝细胞生长因子对实验性急性胰腺炎细胞凋亡作用的研究

目的:观察外源性肝细胞生长因子(HGF)对小鼠轻症实验性急性胰腺炎的炎症反应及胰腺细胞凋亡的作用。方法:以雨蛙肽腹腔注射诱发小鼠轻症实验性急性胰腺炎。第1组以盐水腹腔注射作为对照,第2、3及4组每小时腹腔注射雨蛙肽诱发急性胰腺炎;第3组在造模前及造模中两次皮下注射重组人肝细胞生长因子(rhHGF);第4组同时皮下注射rhHGF及其单抗。观察HGF对炎症反应的干预作用及对腺泡细胞凋亡的影响。结果:炎症小鼠予每公斤体重4、20μgrhHGF时,与单纯炎症组相比,血清淀粉酶、脂肪酶下降,胰腺组织学炎症评分减少,胰腺腺泡细胞TUNEL凋亡指数增加,caspase3活性增强。予每公斤体重4或20μgrhHGF时,其效应无显著性差异。同时予rhHGF单抗的小鼠,上述指标与单纯炎症组相比差异无显著性。结论:HGF能减轻雨蛙肽诱导的小鼠轻症实验性急性胰腺炎。HGF单抗能消除HGF的生物学作用。HGF可以促进急性胰腺炎时腺泡细胞的凋亡,这可能是其保护胰腺的作用机制之一。

奈达铂提高鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的体外实验研究

目的:研究奈达铂(NDP)对鼻咽癌细胞的放射增敏作用及其机制。为寻求治疗鼻咽癌的新策略奠定理论基础。方法:用CCK-8法检测奈达铂对鼻咽癌CNE-2细胞增殖影响和IC50;用克隆形成实验分析奈达铂对CNE-2细胞的放射增敏作用。用流式细胞术(FCM)检测奈达铂对CNE-2细胞凋亡和周期的影响。结果:奈达铂能够抑制CNE-2细胞的增殖,其IC50为32.576 mg/L。1/5IC50浓度(6.515 mg/L)的奈达铂联合放疗与单纯放疗相比,其放射增敏比(SER)为1.542。奈达铂可诱导CNE-2细胞凋亡,奈达铂组、单纯放疗组凋亡率为(22.7+2.24)%、(30.4+2.17)%(P<0.05),奈达铂加放疗组凋亡率最高,为(44.3+1.85)%(P<0.01)。奈达铂作用48 h,对CNE-2细胞周期分布的改变无明显影响。结论:奈达铂通过增强鼻咽癌细胞的凋亡增加放射敏感性。

生精细胞凋亡与男性不育症

近年来,随着对细胞凋亡认识的不断加深,医疗及科研工作者越来越关注细胞凋亡与疾病之间的联系,并为此展开了一系列的试验。现已明确凋亡是人体正常生长发育所必需的,但其失衡也与许多疾病的发生关系密切。生精细胞凋亡过度可能是导致男性不育的重要原因之一。而caspases是细胞凋亡末期的共同通道,对细胞凋亡起着关键性的作用。因此,对caspases家族的活性调控研究可能为治疗男性不育提供新的诊断标准及治疗途径。

miR-223-3p靶向自噬相关蛋白7调控鼻咽癌细胞自噬

目的 探讨miR-223-3p是否靶向自噬相关蛋白7(Autophagy-related 7,ATG7)以调节鼻咽癌细胞的自噬。方法 使用TargetScan分析miR-223-3p与ATG7的相关性。荧光素酶测定法用于检测miR-223-3p是否靶向ATG7。通过Western blot检测miR-223-3p在鼻咽癌细胞CNE2中的过度表达或敲低,检测鼻咽癌细胞CNE2中ATG7的表达以及自噬标记蛋白P62和LC3-Ⅱ的表达。结果 miR-223-3p靶向ATG7的3’UTR位于2791-2798和1583-1589位;当miR-223-3p过表达时,ATG7的表达降低(P<0.05),自噬相关蛋白的表达显著降低(P<0.05),P62和LC3-Ⅱ的表达水平降低,自噬水平降低。敲除miR-223-3p后,ATG7的表达显著增加(P<0.05),自噬相关蛋白P62和LC3-Ⅱ的表达水平显著增加(P<0.05),并且自噬水平增加。结论 miR-223-3p可靶向ATG7 3’UTR的2791-2798和1583-1589位,并抑制人鼻咽癌细胞CNE2的自噬。

肝及肝癌组织缺血再灌注后枯否细胞的凋亡及意义

目的研究肝癌组织缺血再灌注后一氧化氮(NO)和一氧化氮合成酶(iNOS)的改变、枯否细胞(Kupffer cell)的凋亡及其关系。方法通过超声引导将VX2肿瘤组织混悬液穿刺注射到新西兰兔肝脏左中叶,建立肝脏肿瘤模型,用无损伤血管钳阻断肿瘤所在肝叶的肝动脉分支60 min后去除血管阻断恢复血流,随机将模型动物分为缺血再灌注前(对照)、缺血再灌注后0 min1、h1、d3、d、1周6个时间组,取肝脏组织和肿瘤组织,分别测定NO和NOS的含量。用HE染色法观察肝组织和肝癌组织中的枯否细胞凋亡情况。结果肝组织再灌注后0min开始NO和iNOS浓度均明显下降,至再灌注7 d仍处于较低水平(44.41±2.0,3.70±0.2)。在肝癌组织,除NO浓度下降外,iNOS浓度从缺血再灌注0 min至7 d则明显升高(18.45±1.9)。肝组织和肝癌组织的枯否细胞凋亡显著增加,于再灌注1 d和1 h分别达最高峰(13.69±3.1,13.66±1.8)。结论枯否细胞对肝癌组织缺血再灌注过程中的iNOS及NO的产生、细胞损伤与凋亡起重要作用。

小儿肾病综合征激素治疗前后与外周血单个核细胞凋亡关系

为观察小儿肾病综合征(NS)泼尼松治疗前后外周血单个核细胞(PBMC)的凋亡变化,探讨泼尼松诱导细胞凋亡关系及其临床意义,对50例肾病综合征患儿分别在泼尼松治疗前和治疗后第2、4、6、8周采血,进行细胞凋亡形态观察,计算百分率。结果:治疗前凋亡率为(9.94±6.27)％;第2周为(17.30±5.83)％,第4周为(15.60±4.58)％,第6周为(13.60±6.06)％,第8周为(10.18±4.01)％。治疗前与治疗后2、4、6周比较,均P<0.01,差异有显著性;与第8周(减药2周后)比较,P>0.05,差异无显著性。提示NS患儿使用足量泼尼松治疗可诱导外周血PBMC细胞凋亡增加,也诱导大部分患儿病情缓解,当泼尼松减量后诱导细胞凋亡随之减少。观察外周血单个核细胞的细胞凋亡变化对观察NS的激素治疗有一定的临床意义。

心脑宁诱导增生VSMC凋亡及对相关基因表达的影响

目的 :探讨活血化瘀中药血清体外诱导增生血管平滑肌细胞凋亡的作用及其分子机制。方法 :采用流式细胞仪分析 ,DNA电泳分析检测细胞凋亡 ;应用Northen印迹检测bcl- 2、c-myc基因表达活性。结果 :经中药血清处理的血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmuclecell,VSMC) ,可出现典型的凋亡特征 ,DNA电泳呈梯状图谱 ;流式细胞仪分析显示G0 /G1期细胞阻滞现象 ,亚二倍体凋亡细胞增多 ,出现典型的凋亡峰 ,细胞凋亡率与中药血清浓度具有量效关系。杂交结果提示 ,2 0 %中药血清可抑制抗凋亡基因bcl- 2的表达 ,上调促凋亡基因c -myc的mR NA水平。结论 :活血化瘀中药可通过影响凋亡相关基因bcl- 2、c -myc的表达活性而诱导VSMC凋亡。

Bcl-2介导的芹菜素抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用

目的探讨芹菜素(apigenin,Api)在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用,并阐明Api对心肌损伤的保护作用是否主要由Bcl-2介导。方法培养H9c2心肌样细胞;随机分为正常对照(Cont)组、缺氧/复氧(Anoxia/Reoxygenation,A/R)组、Api预处理组、Api+ABT-737组。MTT法检测细胞存活率;Western blot法检测Bcl-2表达;比色法检测培养液LDH活性、细胞SOD及GSH-Px活性、MDA含量;流式细胞仪检测心肌细胞ROS含量、线粒体膜电位及细胞凋亡。结果 Api预处理25 h后,心肌细胞Bcl-2表达呈剂量依赖性上调(P<0.01);细胞存活率升高,培养液LDH活性降低,细胞SOD、GSH-Px活性升高,MDA含量与ROS生成减少,线粒体膜电位更为稳定,细胞凋亡减少(P<0.01);Bcl-2抑制剂ABT-737则可取消Api的上述心肌保护作用。结论Api抗心肌A/R损伤作用涉及Bcl-2信号通路,至少部分依赖于其对Bcl-2表达水平的上调。

Bim介导细胞凋亡的调控及临床意义

Bim是Bcl-2家族成员,只具有一个BH3结构域,可以通过拮抗Bcl-2等抗凋亡因子的作用或直接与Bax等相互作用并共同转位到线粒体膜上引起细胞色素C释放而诱导凋亡。敲除Bim的小鼠表现出自身免疫病,提示Bim参与免疫系统的自我稳态调节。Bim的转录可以被FoxO3、Myb、RUNX3及TGF-beta和TRAIL等因子调控;而JNK对其某些特定位点的磷酸化对调节Bim的活性起着重要作用;同时,Erk1／2可以使Bim特定位点磷酸化后被蛋白酶体降解。Bim与自身免疫病、退行性疾病以及肿瘤的发生发展及治疗都有密切的关系。因而,Bim在细胞凋亡中的基础研究必然为临床治疗提供理论基础与线索。

铜对L-02细胞线粒体的损伤作用

[目的]观察铜对人肝细胞L-02线粒体的损伤作用。[方法]将硫酸铜用D-Hank’s液和培养液稀释成终浓度分别为50、100、150、200μmol/L的硫酸铜与L-02细胞共培养18h,进行量效关系研究;以150μmol/L浓度与L-02细胞共培养0、6、12、18、24h进行时效关系研究。正常对照组:加入与处理组等体积的D-Hank’s液。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测线粒体酶抑制率和整体功能的变化;透射电镜观察线粒体超微结构的变化;罗丹明123(Rh123)和碘化丙啶(PI)结合流式细胞仪(FCM)检测线粒体膜电位(MMP)的变化和细胞凋亡率;免疫细胞化学法检测细胞色素C的释放。[结果]铜可引起线粒体酶抑制率和线粒体功能的变化;透射电镜下观察到线粒体结构受到不同程度的损伤,并随剂量增大和时间延长损伤加重;FCM结果表明随着铜剂量增大,实验组Rh123平均荧光强度逐渐降低,由对照组93.60±18.12下降至200μmol/L组59.94±13.55,即膜电位呈逐渐降低趋势;而细胞凋亡率逐渐增加,由对照组2.73%增加至200μmol/L组17.07%(P<0.05,P<0.01)。随着铜作用时间的延长,Rh123平均荧光强度逐渐降低,由对照组93.60±18.12降低至24h组55.74±15.45,即膜电位呈逐渐降低趋势;而细胞凋亡率逐渐增加,由对照组2.73%降低至24h组20.45%(P<0.05,P<0.01)。免疫细胞化学实验显示,细胞色素C从线粒体释放入胞质,释放量呈现一定的剂量依赖性和时间依赖性。[结论]铜可诱导L-02细胞线粒体损伤,引起膜电位降低,细胞色素C释放入胞质,线粒体结构和整体功能遭破坏,导致细胞损伤甚至凋亡。