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猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆及其原核表达 被引量:6
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作者 王冬梅 刘磊 +3 位作者 逯忠新 赵萍 高鹏程 储岳峰 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2005年第5期373-376,共4页
参照GenBank上登录的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5 型菌株(AF363361)的apxⅠA基因序列设计了1对特异性引物,用PCR法扩增apxⅠA基因,获得了3 069 bp的片段,将其克隆到pMD 18 T载体,经酶切、PCR鉴定和序列分析,表明克隆是成功的。再将长为1 14... 参照GenBank上登录的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5 型菌株(AF363361)的apxⅠA基因序列设计了1对特异性引物,用PCR法扩增apxⅠA基因,获得了3 069 bp的片段,将其克隆到pMD 18 T载体,经酶切、PCR鉴定和序列分析,表明克隆是成功的。再将长为1 149 bp的apxⅠA基因的部分片段(编码ApxⅠ的N 端的片段)插入到原核表达载体pET 28(a)中,构建了重组表达质粒pET apxⅠA,转化大肠埃希氏菌JM109(DE3),在IPTG 诱导下获得了高效表达,经SDS PAGE检测,证实表达产物大小约为41 ku。 展开更多
关键词 胸膜肺炎放线杆菌 apxA基因 克隆 原核表达
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猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxⅠ对小鼠的致病性及免疫原性研究 被引量:1
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作者 马艳芳 刁有祥 +3 位作者 张鑫 纪巍 孙法良 孙宁 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2009年第3期18-22,共5页
将血清10型胸膜肺炎放线杆菌接种于含0.02%NAD、5%犊牛血清、1mMCaCl2的LB液体培养基中培养12h,离心后的上清液经硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶分子筛层析,分离纯化ApxⅠ。将纯化的ApxⅠ进行半数致死量测定,并对小鼠剖检后进行内脏器官病理变... 将血清10型胸膜肺炎放线杆菌接种于含0.02%NAD、5%犊牛血清、1mMCaCl2的LB液体培养基中培养12h,离心后的上清液经硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶分子筛层析,分离纯化ApxⅠ。将纯化的ApxⅠ进行半数致死量测定,并对小鼠剖检后进行内脏器官病理变化观察。将纯化的ApxⅠ与弗氏佐剂按1:1的比例混合制备亚单位疫苗,免疫小鼠,初免2周后加强免疫1次,二免2周后用血清10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,测定最佳免疫剂量。根据最佳免疫剂量于30日龄和45日龄免疫小鼠,60日龄时分别用血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒。结果该毒素对小鼠的LD50为80.9mg/kg,LD50的95%平均可信限为63.2~103.5mg/kg;ApxⅠ亚单位疫苗的最佳免疫剂量为40μg,对血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌的攻击具有一定的免疫保护效果。 展开更多
关键词 胸膜肺炎放线杆菌 毒素apx 致病性 免疫原性
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胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因在不同宿主系统中的表达及密码子偏好性分析 被引量:1
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作者 黄琦 谢芝勋 庞耀珊 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期101-105,共5页
用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954 bp的apxⅠA基因片段,分别构建了大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apxⅠA。对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有... 用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954 bp的apxⅠA基因片段,分别构建了大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apxⅠA。对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1.2%;有49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%。利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apxⅠA分别进行表达。结果显示,目的基因在大肠杆菌中能以包涵体形式进行高效表达,其融合蛋白占菌体总蛋白的32%;在毕赤酵母中则以较低水平分泌表达至培养基的上清液中,40倍浓缩后方能检测到少量目的蛋白。证实,目的基因序列中的密码子偏好性影响其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达。 展开更多
关键词 胸膜肺炎放线杆菌 apx A基因 宿主系统 表达 密码子偏好性
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猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备
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作者 王海丽 葛长城 +1 位作者 徐公义 赵德明 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第12期20-24,共5页
以猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型标准株ApxⅠ天然外毒素为免疫抗原,接种Balb/c小鼠;设计编码ApxⅠN-端具有保护性抗原表位apxⅠA基因(1 149bp)的引物,构建原核表达载体pET-32a-apxⅠA,转化至E.coli BL21,获得分子质量约为41ku的rApx... 以猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型标准株ApxⅠ天然外毒素为免疫抗原,接种Balb/c小鼠;设计编码ApxⅠN-端具有保护性抗原表位apxⅠA基因(1 149bp)的引物,构建原核表达载体pET-32a-apxⅠA,转化至E.coli BL21,获得分子质量约为41ku的rApxⅠA作为包被抗原,用间接ELISA方法筛选单克隆融合细胞上清,共获得2株稳定分泌抗ApxⅠA蛋白mAb的杂交瘤细胞系,亚类鉴定分别为IgG3、IgG2a,2株mAb能特异性地识别ApxⅠA蛋白,为ApxⅠA诊断试剂的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 胸膜肺炎放线杆菌 单克隆抗体 apx A 小鼠
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猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA基因克隆与生物信息学分析 被引量:2
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作者 阮业召 姜家麟 +3 位作者 罗维 郭小权 胡国良 刘平 《湖南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期544-548,共5页
通过提取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA基因组DNA,运用PCR方法扩增ApxⅠA基因片段,并采用TA克隆技术获得pMD18–T–ApxⅠA重组质粒,进行生物信息学分析。结果表明:成功获得长度为1 209 bp的ApxⅠA基因;ApxⅠA蛋白的理化性质稳定;ApxⅠ... 通过提取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA基因组DNA,运用PCR方法扩增ApxⅠA基因片段,并采用TA克隆技术获得pMD18–T–ApxⅠA重组质粒,进行生物信息学分析。结果表明:成功获得长度为1 209 bp的ApxⅠA基因;ApxⅠA蛋白的理化性质稳定;ApxⅠA蛋白有磷酸化位点,但无糖基化位点;信号肽预测ApxⅠA蛋白无信号肽;ApxⅠA蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;预测二级结构主要由无规则卷曲构成,占50.62%,α–螺旋占25.56%,β–折叠占23.82%,三级结构主要由无规则卷曲和β–折叠构成。 展开更多
关键词 猪传染性胸膜肺炎 放线杆菌 apxA基因 分子克隆 生物信息学分析
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、序列分析及表达 被引量:2
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作者 王芳 何孔旺 +5 位作者 邱索平 彭小华 倪艳秀 张雪寒 郭容利 俞正玉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期121-123,共3页
参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型Ⅰ菌株序列设计了一对特异性引物,用PCR方法扩增毒素Ⅰ基因,得到约920bp的片段,与参考序列的核苷酸同源性达99.3%,定向克隆到pET32a(+)中,转化BL21(DE3)
关键词 胸膜肺炎放线杆菌 毒素 表达
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胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠ、ApxⅢ和ApxⅣ的截短表达及免疫反应性鉴定 被引量:1
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作者 于栋 祝可心 +2 位作者 安家慧 叶洋 李玉峰 《畜牧与兽医》 北大核心 2021年第6期84-89,共6页
为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的鉴别诊断方法,在蛋白抗原性和亲疏水性分析的基础上,设计了针对溶血外毒素(Apx)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ截短蛋白的基因扩增引物,以实验室保存的血清2型和血清... 为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的鉴别诊断方法,在蛋白抗原性和亲疏水性分析的基础上,设计了针对溶血外毒素(Apx)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ截短蛋白的基因扩增引物,以实验室保存的血清2型和血清5型菌株基因组DNA作为模板进行特异性基因片段扩增,分别将目的片段克隆至原核表达载体pColdI后转化入Rosetta感受态细胞,通过1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用小鼠抗6×His组氨酸单克隆抗体和猪多抗对表达的重组蛋白上清进行Western blot分析。结果表明:PCR扩增产物与预期大小相符,通过酶切鉴定和测序证明成功构建了重组表达质粒pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ和pColdI-tApxⅣ。诱导表达的蛋白分子量分别为63、50和54 kDa,大小符合预期,可以稳定表达可溶性蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性。该试验的成功开展将为制备APP亚单位疫苗和建立配套的鉴别诊断方法奠定基础。 展开更多
关键词 胸膜肺炎放线杆菌 apx apx apx 原核表达
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