脑靶向N1-羧酰-5-氟尿嘧啶系列化合物体外透过血脑屏障抑制肿瘤细胞活性

目的研究已合成的N1-羧酰-5-氟尿嘧啶系列化合物体外透血脑屏障抑制人星形胶质瘤细胞的活性。方法利用台盼蓝染色显微镜法观察计数方法考查N1-羧酰-5-氟尿嘧啶系列前体药物体外对人星形胶质瘤细胞增殖活性抑制作用;并通过培养大鼠脑毛细血管内皮细胞,建立体外模拟血脑屏障模型,观察N1-维甲酰-5-氟尿嘧啶和N1-山梨酰-5-氟尿嘧啶体外透过血脑屏障模型对人星形胶质瘤细胞增殖活性抑制作用。结果该系列化合物抗人星形胶质瘤活性较5-氟尿嘧啶增强,而对大鼠脑毛细血管内皮细胞的毒性降低;N1-维甲酰-5-氟尿嘧啶和N1-山梨酰-5-氟尿嘧啶较5-氟尿嘧啶透过BBB抑制人星形胶质瘤细胞的作用更好。结论N1-羧酰-5-氟尿嘧啶系列化合物抗人星形胶质瘤活性及透过体外血脑屏障能力都较5-氟尿嘧啶好。

人类疱疹病毒6型感染U251细胞及其生物学功能的研究

目的:研究人类疱疹病毒6型(HHV-6)感染人星形胶质瘤细胞U251,及感染后对其生物学功能的影响。方法:HHV-6感染U251细胞建立HHV-6体外感染模型,倒置显微镜观察细胞病变。PCR法检测HHV-6u22基因。间接免疫荧光(IFA)检测HHV-6即刻早期蛋白(IE1)和晚期蛋白(gB)的表达。MTT法检测U251感染HHV-6后细胞增殖的改变。流式细胞术(FCM)检测U251细胞周期改变。结果:在感染3天后U251出现典型细胞病变,细胞肿胀增大数倍,透亮,呈多形性。PCR检测到HHV-6u22基因。IFA检测到HHV-6IE1蛋白和gB蛋白的表达。MTT法显示HHV-6能增强U251细胞的增殖能力。FCM检测表明,HHV-6感染后U251细胞周期发生改变,感染组和对照组相比,前者G1期的细胞减少,S期和G2期细胞增多。结论:HHV-6能感染U251细胞引起细胞病变,促进细胞的增殖,使细胞周期发生改变。本研究结果提示人类疱疹病毒6型可能参与人神经胶质瘤的发生、发展,对其机制尚不清楚。

表没食子儿茶素没食子酸酯对星形神经胶质瘤U87MG细胞基质金属蛋白酶-2及核因子κB活性影响研究

目的通过研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对星形神经胶质瘤(GBM)细胞系U87MG细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)活性的抑制作用及对核因子κB(NF-κB)活性的影响,探讨EGCG对恶性胶质瘤细胞的作用机制。方法体外培养U87MG细胞,用EGCG预处理后,四氮唑盐酶还原法检测细胞的增殖及乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率;明胶酶谱实验和实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MMP-2的酶活性和m RNA表达水平;Western blot检测p65的核转位。为进一步探讨NF-κB与MMP-2基因表达的关系,U87MG细胞与EGCG孵育的同时,加入25μmol/L NF-κB特异性抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)共同孵育,RT-PCR检测其对MMP-2表达的影响。结果 EGCG与佛波酯(PMA)诱导后的U87MG细胞共孵育后,当浓度<20μmol/L时,以剂量依赖性方式降低MMP-2 m RNA及其蛋白的表达。明胶酶谱实验显示,EGCG也能以剂量依赖性方式降低MMP-2的酶活性。PMA诱导后的U87MG细胞与EGCG共孵育后,转移至核内的p65蛋白随着EGCG浓度的增加而明显减少。NF-κB特异性抑制剂PDTC能协同EGCG下调MMP-2m RNA表达。结论 EGCG通过抑制NF-κB的转位,在基因和蛋白水平抑制PMA诱导的U87MG细胞MMP-2的表达及其酶活性。

星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离、培养与鉴定

背景:肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分具有无限增殖潜能和自我更新能力,能够分化为成熟细胞表型的干细胞样细胞,对肿瘤发生、增殖、侵袭起关键作用。目的:建立体外分离、培养与鉴定星形胶质细胞瘤干细胞的方法。方法:采用直接培养法分离培养星形胶质细胞瘤干细胞。参照神经干细胞培养条件,进行体外培养。观察其增殖、分化并进行巢蛋白、CD133免疫细胞化学鉴定和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白及O4免疫细胞化学鉴定。结果与结论:培养7-10d,可形成大量悬浮生长巢蛋白及CD133免疫阳性的神经球,经诱导分化后细胞呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白或O4免疫阳性。提示星形胶质细胞瘤中存在具有神经干细胞特性的肿瘤干细胞。CD133和巢蛋白是星形胶质细胞瘤干细胞重要的表面标记,可以用于星形胶质细胞瘤干细胞的分离。

脑星形胶质细胞瘤MRI和病理对照研究

目的 :探讨脑星形胶质细胞瘤病理分级和MRI影象学表现之间的关系。方法 :回顾性分析 81例经手术和病理证实为脑星形胶质细胞瘤MRI资料 ,综合分析MRI表现并与病理结果对照。结果 :Ⅰ级星形胶质细胞瘤肿瘤信号均匀、占位效应较轻 ,无瘤内血管及出血 ,增强程度较轻、也较均匀 ( 77.7% ) ;Ⅲ～Ⅳ级星形胶质细胞瘤肿瘤信号不均匀、占位效应明显 ,瘤内血管 ( 5 6.67% )及出血 ( 3 3 .3 3 % )多见 ,呈不均匀明显强化 ;Ⅱ级星形胶质细胞瘤介于两者之间。结论 :MRI显示瘤内血管对定性有帮助 ;不同分级的星形胶质细胞瘤具有一定的MRI特征性 ,术前有可能作出推测性诊断。

42例脑星形胶质细胞瘤P53蛋白表达及与PCNA的关系

目的：观察人脑星形胶质细胞瘤中Ｐ５３蛋白的表达及与增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达的关系，以深入探讨Ｐ５３蛋白的表达在脑星形胶质细胞瘤发生中的作用。方法：用Ｐ５３蛋白抗体ＰＡｂ１８０１和ＰＣＮＡ的抗体Ｐｃ１０检测４２例脑星形胶质细胞瘤切除标本，以阳性指数的表达方式，对两种免疫组化的结果进行定量，并对其中资料完全的３５例Ｐ５３蛋白和ＰＣＮＡ的阳性指数进行相关性分析。结果：在各级星形胶质细胞瘤中均有Ｐ５３阳性表达；Ｐ５３阳性指数分别为Ⅰ级１４．６６±１３．９７，Ⅱ级３６．５４±１９．２４，Ⅲ～Ⅳ级２８．８７±２５．２５；Ⅰ级和Ⅱ级组有显著差异（Ｐ＜０．０５）。Ｐ５３和ＰＣＮＡ两者的阳性指数呈非常显著的正相关（ｒ＝０．５１２）。结论：提示Ｐ５３蛋白在调控细胞增殖、促成脑星形胶质细胞瘤的生成中具有一定作用。

斑蝥素酸镁对人星形胶质瘤细胞U-251MG生长、凋亡和侵袭的影响及机制研究

目的探讨斑蝥素酸镁对人星形胶质瘤细胞U-251MG生长、凋亡和侵袭的影响及机制。方法体外培养人星形胶质瘤细胞U-251MG,分为空白组(Control组)、低剂量斑蝥素酸镁组(Canthardin 5μM组)、中剂量斑蝥素酸镁组(Canthardin 10μM组)和高剂量斑蝥素酸镁组(Canthardin 20μM组)。采用克隆形成实验检测细胞增殖情况;Hocest染色检测细胞凋亡情况;Transwell法检测细胞侵袭情况;Western blot检测相关蛋白表达情况。结果平板克隆实验结果显示,斑蝥素酸镁可以明显抑制人星形胶质瘤细胞U-251MG的增殖,且呈剂量依赖性(P<0.05);Hocest染色结果显示,斑蝥素酸镁可以明显促进人星形胶质瘤细胞的凋亡,且呈剂量依赖性(P<0.05);Transwell小室实验显示,斑蝥素酸镁可以显著抑制细胞的侵袭,且呈剂量依赖性(P<0.05);Western blot检测结果显示,斑蝥素酸镁处理后,人星形胶质瘤细胞中PCNA蛋白、VEGF蛋白、Bax蛋白及p-AKT蛋白表达均显著降低(均P<0.05),Caspase-3蛋白、Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05),AKT总蛋白表达无显著差异(P>0.05)。结论斑蝥素酸镁可以通过调控Akt信号通路抑制人星形胶质瘤细胞U-251MG的增殖和侵袭,并促进其凋亡,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。

TP、MVD在人脑星形胶质细胞瘤中的表达及意义

目的探讨脑星形胶质细胞瘤组织胸苷磷酸化酶(TP)和微血管密度(MVD)的表达及其与星形细胞瘤的病理分级关系。方法选取病例50例,记录病例年龄、性别、组织学类型、病理分级。正常脑组织病例5例,鼠抗人单克隆抗TP抗体选取乳腺炎石蜡标本1例(阳性对照)。鼠抗人单克隆抗CD34抗体选取扁桃体炎石蜡标本1例(阳性对照)。将上述符合条件病例蜡块每例切片3张,利用免疫组化技术SP法检测它们TP、CD34的表达。结果5例正常尸检脑组织TP表达均阴性(-);高级别星形胶质细胞瘤TP阳性表达率及微血管密度(MVD)值明显高于低级别星形胶质细胞瘤(WHOⅠ～Ⅱ级)(P<0.05)。且TP表达与MVD明显正相关(r=0.692,P<0.05)。结论TP及MVD可以作为星形胶质细胞瘤恶性程度病理分级及判定预后的参考指标。

星型胶质细胞瘤预后生物标志物的筛选

目的应用生物信息学的方法筛选参与星型胶质细胞瘤的预后生物标志物。方法首先,下载GEO(gene expression omnibus,GEO)数据库中星型胶质细胞瘤的基因芯片数据,通过R语言将来自4个数据集的基因芯片数据进行合并,将合并后的194人来源的脑组织样本分为:星型胶质细胞瘤组和正常组。然后对原始基因芯片数据进行批次效应去除和标准化处理,并使用密度图和主成分分析监测处理前后的效果。利用R语言中的limma包对处理后的基因芯片数据进行差异表达分析,从而筛选得到星型胶质细胞瘤组和正常组中之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。接着对差异表达基因进行GO(gene ontology,GO)分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析,并对所有基因的表达矩阵进行GSEA(gene set enrichment analysis,GSEA)分析。通过STRING数据库构建差异表达基因的蛋白—蛋白相互作用网络(protein-protein interaction,PPI),通过Cytoscape中的cytoHubba插件筛选Hub基因。为了探索Hub基因在星型胶质细胞中的诊断价值和预后价值,我们下载TCGA(the cancer genome atlas,TCGA)数据库中的基因表达数据和临床预后资料,使用ROC曲线评价Hub基因的诊断价值,并对诊断价值较高的Hub基因进行COX回归,筛选HR值最有意义的基因进行总生存分析(overall survival,OS)。结果通过limma包总共分析得到1043个差异表达基因。GO分析结果表明差异表达基因主通过影响神经突触的功能而发挥作用。KEGG分析结果显示钙信号通路、cAMP信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路和Ras信号通路等通路等在星型胶质细胞瘤中发挥着重要的作用。GSEA富集分析结果主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、逆行内源性大麻素信号、神经活性配体-受体相互作用、GABA能突触和钙信号通路等通路。通过PPI网络总共分析得到ADCY1、ANXA1和PENK等20个Hub基因。通过对Hub基因的诊断价值和预后价值进行评价,发现SST在星型胶质细胞瘤既可作为诊断标志物,也可作为预后生物标志物。结论我们通过生物信息学分析发现SST可作为星型胶质细胞的预后生物标志物,又预测了Rap1信号通路有可能成为星型胶质细胞分子机制中的新通路。

FOXO4和nNOS在星型胶质细胞瘤中的表达及意义

目的:观察转录因子叉头框蛋白O4(FOXO4)和神经型一氧化氮合酶(nNOS)在星型胶质细胞瘤中的表达,探讨星型胶质细胞瘤恶性程度发生发展的的机制,进而寻找可能的药物治疗靶点。方法:从弋矶山医院病理科调取星形胶质细胞瘤27例蜡块标本。运用双盲法进行免疫组织化学和免疫荧光染色,检测各例星型胶质细胞瘤组织中FOXO4、nNOS的表达。结果:FOXO4在Ⅰ~Ⅳ级星形胶质细胞瘤组织中的阳性表达,随着肿瘤级别的升高而逐渐降低(P<0.05)。而随着星形胶质细胞瘤级别升高,nNOS的阳性表达也越来越高(P<0.05)。结论:FOXO4阳性表达的减少,nNOS阳性表达的增强,可能与星形胶质细胞瘤瘤恶性程度发生发展有关;调控FOXO4、nNOS的异常表达可能是新的治疗药物靶点之一。

脑胶质细胞瘤中PAK5的表达及意义

目的 探讨p-21激活激酶5（PAK5）在脑胶质细胞瘤中的表达情况以及对于脑胶质细胞瘤发生发展的意义.方法 采用免疫组织化学SP法检测78例正常脑组织及脑胶质细胞瘤中PAK5的表达水平.结果 PAK5在高度恶性脑胶质细胞瘤中的表达量明显增高,PAK5在正常及癌旁组织和脑胶质细胞瘤组织中的表达量与性别、年龄因素无关.结论 PAK5在高度恶性脑胶质细胞瘤组织中表达量明显增高可能与PAK5主要促进脑胶质细胞瘤的迁移和侵袭有关。

星形胶质细胞瘤MRI与病理诊断50例对照分析

目的 探讨星形胶质细胞瘤的MRI表现特点 ,分析MRI对该类肿瘤的诊断要点和价值。方法 搜集经MRI诊断及手术病理证实的星形胶质细胞瘤 5 0例 ,分析MRI信号表现特点。结果 发现Ⅰ级星形胶质细胞瘤边界多较清楚 ,信号较均匀 ,水肿及占位效应较轻 ,囊变少见 ;Ⅲ～Ⅳ级星形胶质细胞瘤边界多不清楚 ,信号不均 ,水肿及占位效应明显 ,囊变多见 ;Ⅱ级介于二者之间。结论 不同分级的星形胶质细胞瘤的MRI表现有一定规律性 。

高表达OTUD3对C6星形胶质瘤细胞增殖的影响

目的探究高表达OTUD3对C6星形胶质瘤细胞增殖的影响。方法C6胶质瘤细胞转染Myc-OTUD3质粒载体48 h后,采用Western Blot方法检测OTUD3蛋白表达变化;采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖试剂盒和细胞克隆形成实验检测高表达OTUD3的C6胶质瘤细胞增殖改变情况。结果转染Myc-OTUD3质粒载体48 h后,C6胶质瘤细胞OTUD3蛋白表达升高(t=3.472,P<0.01)。CCK-8和细胞克隆形成实验结果显示,高表达OTUD3的C6胶质瘤细胞增殖水平降低(F=17.326、70.345,t=3.646,P<0.05)。结论高表达OTUD3可抑制C6星形胶质瘤细胞的增殖。

尼莫地平注射液抑制ERK1/2和P38 MAPK的磷酸化对人星形胶质瘤细胞U-251 MG生长和运动的抑制作用

目的采用体外培养人星形胶质瘤U-251MG细胞为研究对象,探讨尼莫地平注射液(Nimodip-ine,Nim)对其生长和运动的影响及其机制.方法CCK8法检测不同浓度Nim处理U-251MG后细胞存活率,选择无明显毒性的3个剂量进行后续实验.将细胞随机分为对照组、Nimodipine 0.125 mg组、Nimodip-ine 0.25 mg组和Nimodipine 0.5 mg组,采用Edu染色检测细胞增殖;Hoechst检测细胞凋亡情况;Transwell检测细胞侵袭;划痕实验检测细胞迁移;镜下观察细胞形态变化;Western印迹检测增殖相关蛋白Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA),凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、caspase-9,上皮间质转换(EMT)相关蛋白上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、神经钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达水平及信号通路细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、P38丝裂原活化蛋白酶(P38MAPK)的磷酸化水平.结果当Nim浓度达到1 mg/L时,可以对U-251MG细胞产生明显的细胞毒性,故选择无明显细胞毒作用的0.125、0.25和0.5 mg/L 3个剂量进行后续试验.Nim能剂量依赖性的抑制体外培养U-251MG细胞的增殖、侵袭和迁移能力,增加细胞凋亡率;促进E-cadherin,抑制caspase-3、caspase-9、Vimentin、N-cadherin、p-ERK1/2和p-P38的蛋白表达.结论Nim能有效调节人星形胶质瘤U-251MG细胞的生长和运动能力,其机制与调节ERK1/2和P38MAPK信号通路的磷酸化有关.

人巨细胞病毒感染诱导U251星形胶质瘤细胞凋亡及其差异蛋白的表达

目的分析人巨细胞病毒(HCMV)感染对人星形胶质瘤细胞凋亡的影响及其细胞内差异蛋白的表达。方法以HCMV AD169株感染U251细胞,复制HCMV体外感染模型,通过RT-PCR和免疫细胞化学技术检测HCMV IE蛋白和结构蛋白pp65的表达。用AnnexinⅤ-FITC和PI染色检测细胞凋亡,通过SELDI-TOF质谱分析感染细胞内差异蛋白的表达。结果HCMV感染后6 h,U251细胞经RT-PCR可扩增出242 bp的IE基因条带,感染后3 d,细胞核内有大量IE蛋白表达,核周及细胞浆内有大量pp65蛋白表达。病毒感染后3 d,约47%的细胞产生凋亡。HCMV感染后细胞内Caspase-8和磷脂酶A2的表达明显增加。结论HCMV感染可能通过上调Caspase-8和磷脂酶A2的表达而诱导U251星形胶质瘤细胞产生凋亡损伤。

星形细胞瘤的影像学表现与病理学分级的对照性研究

目的探讨不同分级的星形细胞瘤影像学表现。方法回顾分析67例经手术病理证实的Ⅰ～Ⅳ级星形细胞瘤影像学表现。结果Ⅰ级星形细胞瘤5例，轻微占位效应1例，信号均匀5例，无瘤内血管及出血，轻度增强4例，其中均匀3例，欠均匀1例；Ⅱ级46例，占位效应11例，较轻，信号均匀41例，瘤内血管9例，出血4例，均匀增强41例，其中均匀32例，欠均匀9例；Ⅲ～Ⅳ级16例，占位效应14例，信号不均匀15例，瘤内血管14例，9例出血，不均匀明显强化15例；信号不均、占位效应明显，瘤内血管6例及3例出血，呈不均匀明显强化。Ⅲ-Ⅳ级与Ⅰ、Ⅱ级星形细胞瘤影像学表现具差异性有统计学意义（P〈0．05）。结论不同分级的星形细胞瘤具有一定的MRI特征性，不均匀信号和强化、瘤内血管及出血坏死对诊断Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤有帮助。

外泌体MicroRNA-1246促进星形胶质瘤细胞增殖与侵袭的研究

目的探讨星形胶质瘤细胞来源的外泌体中microRNA-1246(miRNA-1246)是否作用于星形胶质瘤细胞,促进其增殖与侵袭。方法实验分为对照组、miRNA-1246抑制剂组与miRNA-1246模拟物组,各组设6个复孔。首先从患者血液中分离外泌体并鉴定其成分。通过基质胶包被的Transwell小室实验检测星形胶质瘤细胞在miRNA-1246作用下侵袭能力的变化,CCK-8实验检测细胞增殖能力。利用荧光素酶报告基因验证miRNA-1246是否靶向细胞黏附分子1 (CADM1)基因。最后通过Western Blot实验与RT-qPCR实验检测癌症组织中CADM1蛋白水平的含量并分析其与胶质瘤的关系。采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果恶性胶质瘤患者血液循环外泌体中miRNA-1246的含量为2.83±1.70,高于对照组1.00±0.5 0,差异具有统计学意义(t=6.044,P=0.026)。转染miRNA-1246抑制剂后细胞CADM1蛋白水平为1.79±0.17,高于对照组1.00±0.09(t=4.576,P=0.017),细胞侵袭数量为(48.40±5.90)个,低于对照组96.50±6.70,而转染miRNA-1246模拟物后细胞侵袭数量为(123.20±9.80)个,高于对照组(96.50±6.70)个(t=5.258,P=0.002)。CCK-8实验中转染miRNA-1246抑制剂组A450值为0.49±0.08,低于对照组0.76±0.06,而转染miRNA-1246模拟物组A450值为1.03±0.09,显著升高(F=33.82,P=0.005)。荧光素酶报告实验表明细胞转染miR-1246模拟物后荧光强度为4.98±1.86,低于对照组10.34±2.60(t=7.235,P=0.006),而CADM1-Mut组内之间比较差异无统计学意义。结论胶质瘤细胞外泌体中的miRNA-1246可通过靶向CADM1基因抑制蛋白表达,促进胶质瘤细胞的增殖与转移,提示循环外泌体中的miRNA-1246可作为恶性胶质瘤诊断与治疗的潜在靶点。