阿维菌素B1a组分高产菌株的定向选育

以阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)1-17为出发菌株,分别使用紫外线及亚硝基胍并结合L-异亮氨酸诱导手段进行诱变处理,得到AVMB1a组分摇瓶发酵水平较出发菌株提高12.86%的突变株3-6。传代实验表明该菌株的高产性能稳定。结果表明,采用UV、NTG诱变结合L-Ile诱导的手段可以获得B1a组分显著提高的菌株。

Avermectin B_(1a)组分高产菌株的诱变育种

目的了解averm ectin产生菌S.averm itilis的生长特性,提高产生菌B1a组分的产量。方法采用紫外线、诱变剂亚硝基胍并结合甲硫氨酸诱变等手段对出发菌株S.averm itilis N-5-6进行诱变处理,初筛、复筛。结果筛选获得总效价达到4525.8μg/m l的高产除虫链霉菌突变株A-3,B1a比例提高到56.0%。结论采用紫外线及亚硝基胍诱变方法,结合甲硫氨酸诱变筛选,与出发菌株相比可以获得averm ectin总效价及B1a组分显著提高的菌株。

Synthesis of 4″-benzyloxyimino-4″-deoxyavermectin Bla derivatives

Six new 4＂-benzyloxyimino-4＂-deoxyavermectin B la derivatives were synthesized from avermectin Bla by the selective protection of C-5-hydroxy group, oxidation of C-4＂-hydroxy group, and deprotection followed by reaction with O-substituted hydroxylamine hydrochlorides. Their structures were confirmed by IR, 1H NMR, 13C NMR and MS. Insecticidal activities of the derivatives against Phopalosiphum pseudobrassicae, Spodoptera exigua and Pluteua xylosteua were evaluated.

5-苄氧亚氨基-5-脱氧阿维菌素B1a的合成

以阿维菌素B1a为原料经过选择性氧化合成5-氧代-5-脱氧阿维菌素B1a,再与O-取代羟胺盐酸盐反应合成了5个5-苄氧亚氨基-5-脱氧阿维菌素B1a(4a～4e),通过1HNMR,CNMR,MS,IR确证了它们的结构.生测结果表明它们13对于棉铃虫和甜菜夜蛾有一定的杀虫活性.

微波辅助萃取-液相色谱-串联质谱法测定植物源产品中的阿维菌素B1a残留量

建立了植物源产品茶叶、粮谷、中药材中阿维菌素B1a残留量的液相色谱–串联质谱(LC–MS/MS)测定方法。样品用丙酮–二氯甲烷(体积比1∶1)微波辅助提取,提取液经石墨化炭黑/氨基(Carb/NH2)固相萃取小柱净化。采用Hypersil Gold C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,5μm),乙腈–2.5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相,以电喷雾电离正离子(ESI+)、多反应监测模式(MRM)定性、定量测定阿维菌素B1a,采用基质标准曲线外标法定量。在5～100μg/L范围内,阿维菌素B1a的峰面积与质量浓度呈线性关系,相关系数大于0.998,方法的检出限(S/N>3)为5μg/kg,定量限(S/N>10)为10μg/kg。取有代表性的绿茶、小麦、丹参阴性样品进行加标回收试验,在10,50μg/kg加标水平下,回收率为75%～87%,相对标准偏差为4.04%～6.38%(n=5)。该法提取效果好、净化较彻底,灵敏度满足国内外限量标准的要求,适合复杂基质植物源产品中阿维菌素B1a残留量的测定。

三种兽药在不同暴露系统对蚯蚓的急性毒性

采用人工土壤法和滤纸法对不同浓度的阿维菌素、安普霉素、磺胺二甲基嘧啶3种常用兽药对蚯蚓的急性毒性进行了研究。结果表明,用土壤法和滤纸法测定的阿维菌素对蚯蚓的半数致死浓度(LC50)分别为17.06mg·kg-1和4.63×10-3mg·cm-2,阿维菌素对蚯蚓具有一定的毒性作用,其皮肤接触毒性比土壤食入毒性更大。用滤纸法测定的安普霉素、磺胺二甲基嘧啶对蚯蚓的半数致死浓度(LC50)分别大于10mg·cm-2和15mg·cm-2;用土壤法测定安普霉素、磺胺二甲基嘧啶对蚯蚓的半数致死浓度(LC50)均大于5000mg·kg-1,表明安普霉素、磺胺二甲基嘧啶对蚯蚓的毒性较低。

阿维菌素B_(1a)对土壤微生物和蚯蚓的影响

研究了不同阿维菌素B1a浓度对4种土壤微生物生长和呼吸强度的影响及对土壤中蚯蚓的急性毒性.结果表明,土壤中阿维菌素B1a浓度在83.3 mg.kg-1以上时对4种土壤细菌均表现出明显的抑制作用,但对土壤真菌不表现抑制作用.高浓度阿维菌素B1a对土壤微生物的呼吸强度有抑制作用,并且在不同土壤其作用有差异.采用滤纸接触试验和人工土壤试验测定阿维菌素对蚯蚓的急性毒性(半数致死量,LD50),接触毒性LD50为4.63μg.cm-2,土壤法试验测定的LD50在处理后第7 d和第14 d分别为24.13和17.06 mg.kg-1.

埃维菌素长效控释丸在绵羊体内的药物动力学研究

用反相高效液相色谱法测定埃维菌素长效控制释放丸在血浆和胃液中的药物动力学，所测成分为埃维菌素Ｂ１ａ。流动相为乙腈：甲醇：水＝７２：１８：１０，紫外检测波长为２４５ｕｍ，流速１ｍｌ／ｍｉｎ。结果表明埃维菌素长效控释丸在绵羊体内稳定释放，可持续１１０天以上，血浆和胃液中埃维菌素Ｂ１ａ的浓度分别为８．３７±１．９０ｎｇ／ｍｌ和４１．２４±２３．４１ｎｇ／ｍｌ。

飞船搭载菌株的阿维菌素B_(1a)组分分析

阿维链霉菌HY1进行飞船搭载后,筛选得到了24株高产且遗传性状稳定的菌株,它们的总效价比出发菌株HY1提高24%以上,最高的达到了83%.同时,用HPLC法筛选B1a化学效价较高菌株,最终得到菌株2株,其中菌株HY365的总效价为5 924.7 mg/L,它的B1a化学效价为3 894.8 mg/L,占总效价的比例达到65.74%;HY516的B1a化学效价为3 151.9 mg/L,占总效价的59.90%.

毒死蜱·阿维菌素复配剂对棉铃虫表皮穿透能力研究

本文报道用高效液相色谱法来测定复配剂及各复配单剂对棉铃虫幼虫的表皮穿透能力。研究发现毒死蜱与阿维菌素复配后能相互促进对方对害虫表皮的穿透,并且毒死蜱对阿维菌素的促进作用要大于阿维菌素对毒死蜱的促进作用;复配剂的表皮穿透速率明显提高,处理后10h实际表皮穿透率（94.5％）已相当于其处理后24h理论表皮穿透率（94.0％）.

低能N^+离子注入阿维菌素B_(1a)生产菌的诱变选育

以阿维菌素生产菌阿维链霉菌为研究对象,通过低能N^+离子注入法对阿维链霉菌进行诱变选育。根据其存活率和突变率,确定最佳的诱变条件为:诱变能量为16 keV,诱变剂量为160×10^(14) ions/cm^2。经过诱变后筛选获得高产突变菌株AVE-10-N102-26。该菌株发酵产阿维菌素B_(1a)含量为3 012μg/mL,较出发菌株AVE-10提高了25.7%;经多次传代试验结果证明其遗传稳定性较好。

阿维菌素B_(1a)衍生物合成研究

目的高效率合成几种阿维菌素B_(1a)衍生物。方法通过5-O-三苯硅基阿维菌素B_(1a)与羧酸在4-二甲氨基吡啶(DMAP)等存在下发生酯化反应合成得到数种目标衍生物。结果反应以较好的收率得到3种阿维菌素B_(1a)衍生物。结论生物活性试验结果表明,这些不同取代基团对化合物的杀虫活性有不同的影响,其中部分化合物具有较好的杀虫、杀螨活性。

产高纯度阿维菌素B组分的阿维链霉菌突变株

对某生产菌株MA-1进行诱变的过程中筛选得到一株新菌株MA-2,通过TLC和HPLC分析,确认其发酵产生的活性成分只有B组分,包括B1a和B2a两种主要成分,以及微量B1b成分。经多次菌株传代培养,表明这一组分组成的稳定性良好。

阿维菌素B_(1a)组分高产菌株的诱变育种

目的了解阿维菌素产生菌S.avermitilis的生长特性,提高产生菌B1a组份的产量。方法采用紫外线(UV)、诱变剂氯化锂(LiCl),亚硝基胍(NTG)并结合甲硫氨酸(Met)诱导等手段对出发菌株S.avermitilisH0065进行诱变处理,初筛、复筛。结果筛选获得总效价达到4524.3μg/ml的高产阿维菌突变株N-3-133,其中B组分含量显著提高且高达85.3%,B1a也显著提高达到2533.6μg/ml。结论采用紫外线及亚硝基胍诱变方法,结合甲硫氨酸诱导筛选,与出发菌株相比可以获得阿维菌素总效价及B1a组分显著提高的菌株。

SPE-HPLC法测定枸杞中阿维菌素B_(1a)残留量

建立了固相萃取前处理净化技术．高效液相色谱（HPLC）法检测枸杞中阿维菌素B1a残留量的方法。样品用乙腈提取，经C18固相萃取柱净化，采用C18柱（250mm×4．6mm i．d．，5μm）分离，以V（甲醇）：V（水）=85：15为流动相，在245nm下进行检测。阿维菌素B1a在0．20～2．00μg／mL范围呈良好的线性关系（r=0．9994）；该方法检出限（S／N=3）为0．02mg／kg；添加回收率为88．3％～102．5％，相对标准偏差为2．1％～3．8％。

偶氮苯-阿维菌素B1a衍生物的合成及活性调控研究

[目的]为将光药理学方法应用于农药学研究。[方法]在阿维菌素B1a分子的C5-OH引入光致异构基团偶氮苯。[结果]合成了3个偶氮苯-阿维菌素衍生物,测试了光物理化学性质和生物活性。这些衍生物光致异构反应的转化率为42%~47%,具有良好的抗疲劳性和热稳定性。化合物3a对蚊幼虫和黏虫、3c对蚊幼虫的活性较好,但光照前后活性差异较小。[结论]偶氮苯-阿维菌素衍生物的顺反异构变化可以被光可逆控制,具有成为新型光控活性分子的潜能。

阿佛曼链霉菌的^(12)C离子辐照效应及高产菌株选育

选用12C6+离子辐照诱变阿维菌素B1a产生菌ZJAV-A1,研究其诱变效应。实验结果表明,12C6+离子辐照剂量50Gy时致死率97%,正突变率最高可达到34.2%。通过12C6+离子诱变处理,结合平板培养基及斜面培养基的正突变菌株筛选,最终获得一株稳定性良好,阿维菌素B1a组分产量稳定在4460—4588μg/ml之间,较出发菌株提高11.1%—14.7%的突变株ZJAV-Y1-203。

含酰胺结构的4"-阿维菌素三唑类衍生物的合成及杀虫活性

根据活性亚结构拼接原理,以阿维菌素B1a为先导化合物,经过酰胺化和点击反应合成了一系列含酰胺结构的4"-阿维菌素三唑类衍生物,并通过1H NMR、13C NMR和高分辨质谱对目标化合物进行结构表征.初步的生物活性测定结果表明,目标化合物对朱砂叶螨、桃蚜和秀丽隐杆线虫均具有一定的杀虫活性.在0.1μg/m L浓度下,4"-(1-(4-(2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰胺基)-1H-1,2,3-三唑基)乙酰胺基)阿维菌素B1a(11b)和4"-(1-(4-氯苯甲酰胺基)-1H-1,2,3-三唑基)乙酰胺基)阿维菌素B1a(11e)对朱砂叶螨的杀虫活性达到83.5%和81.2%;4"-(1-(2-氨基-3-甲基苯乙酰胺基)-1H-1,2,3-三唑基)乙酰胺基)阿维菌素B1a(11i)对桃蚜(c:50μg/m L)和秀丽隐杆线虫(1μg/m L)的杀虫活性分别为86.4%和74.6%,优于对照药阿维菌素B1a.

阿维菌素B_(1a)纯物质的制备纯化研究

本研究致力于制备纯化出高纯阿维菌素B1a,为核磁定量及质量平衡法提供计量溯源纯物质,从而给阿维菌素标准物质(研制中)纯度定值时提供纯度参考标准。利用制备型液相色谱对阿维菌素原料(B1a含量为95.71%)进行纯化,除去痕量杂质,真空干燥及冷冻干燥后得到阿维菌素B1a高纯物质。建立了基于制备液相色谱-真空干燥的阿维菌素B1a高纯物质的制备纯化工艺:采用Agilent Prep HT XDB-C18型制备柱,流动相为水/甲醇(15∶85),进样量500μL,流速20.0m L/min。经超高效液相色谱(UPLC)检测,产品纯度达到99.74%,可以满足核磁定量及质量平衡法的要求,并利用液相色谱串联质谱以及核磁共振法对产品进行定性分析。

细胞工厂代谢转换机制及其智能生物制造

微生物新药的产业化和高效制造是国家重大需求。然而天然产物作为次级代谢产物并非微生物生存所必需,以生存为目标的自然演化使微生物只在营养困乏期或者应激反应时才精确调控少量产生。尽管大量次级代谢产物的生物合成途径都得到了阐明,但初级代谢和次级代谢之间的转换机制仍不清楚,已成为制约细胞工厂高效生物制造药物的瓶颈。建立合成生物学5M策略和活细胞代谢实时监测工具是解决该科学问题的关键。本文聚焦链霉菌聚酮类化合物代谢转换机制的研究和智能制造,利用开发的系列特异性监测NAD(H)、NADP(H)的遗传编码荧光探针,详细解析了链霉菌胞内三酰甘油(TAGs)的降解机制,通过设计符合原子经济性原则的产物生物合成途径、动态精细调控等策略大幅度提高几种聚酮类药物(actinorhodin,jadomycin B和oxytetracycline)产量,其中阿维菌素B1a的工业生产效价提高了50%以上,达到有史以来最高的效价。