一株鸽副黏病毒Ⅰ型分离鉴定及致病性分析

在天津的病死鸽病料中分离鉴定鸽副黏病毒Ⅰ型(pigeon paramyxovirus-1,PPMV-1),并对其进行遗传演化、生物学特性、致病性分析,为鸽副黏病毒Ⅰ型疫苗的研发提供科学依据。采用RT-PCR方法进行病原检测,在SPF鸡胚上分离纯化病毒;经遗传演化分析、致病性分析及动物回归试验对病毒分离株进行全面分析。结果显示:病死鸽的脏器样品经RT-PCR鉴定为NDV核酸阳性;鸡胚分离纯化后得到1株鸽副黏病毒Ⅰ型毒株,命名为Pigeon/TJ/CH/020/2020(TJ20)。通过对病毒F基因测序及进化树分析,确定该分离毒株属于ClassⅡ类Ⅵ.2.1.1.2.2(原Ⅵk)基因亚型,裂解位点的氨基酸残基为112 R-R-Q-K-R-F^(117),符合NDV强毒株的分子特征。交叉血凝抑制试验显示TJ20株与LaSota疫苗株存在明显的抗原性差异。TJ20株的鸡胚半数感染量(EID_(50))为10^(-8.38)·0.1 mL^(-1)、细胞半数感染量(TCID_(50))为10^(-8.64)·0.1 mL^(-1)、鸡胚平均致死时间(MDT)为62 h、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.19。动物感染试验结果表明,1月龄鸽人工感染TJ20株后第4天开始出现嗜睡、垂翅、腹泻、瘫痪、斜颈扭头等新城疫典型临床症状,发病率和死亡率均为100%。本研究从病死鸽组织中成功分离出一株具有高致病性的Ⅵ.2.1.1.2.2(原Ⅵk)基因亚型的TJ20毒株,为后续鸽副黏病毒Ⅰ型疫苗研发提供了重要的生物学材料。

番鸭副粘病毒1型的分离鉴定

自表现神经症状、腹泻、病死率较高、腺胃粘膜局灶性出血或溃疡及肠道粘膜出血为特征的病死番鸭肝脏中分离到病毒 ,经电镜观察、血凝及血凝抑制试验鉴定为副粘病毒 1型。以SPF鸡胚测定其平均致死时间 (MDT)为 5 1h ,对 1日龄SPF鸡的脑内接种致死指数 (ICPI)为 1 74 ,表明该毒株属强毒株。经肌肉注射途径攻击 10d雏番鸭致死率达6 6 7% 。

半番鸭源禽1型副粘病毒FM01株的分离鉴定与F蛋白基因分析

从表现类似新城疫症状的病死半番鸭中分离到1株病毒FM01株,经血凝及血凝抑制试验证实为禽1型副粘病毒。以SPF鸡胚测定其平均致死时间为113.4h,对1d雏鸡脑内接种致病指数为0.23,表明为温和型毒株。利用RT-PCR技术一次性扩增其F蛋白全基因,克隆到pMD18-T质粒载体,测序后获得F基因全序列,并推导出其相应的氨基酸序列。FM01株的F蛋白基因完整的编码区全长1662bp,编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,具有温和型毒株特有的氨基酸序列结构。与常见新城疫毒株的核苷酸同源性在88.4%～99.6%之间,氨基酸同源性在89.2%～99.1%之间。

雏番鸭感染禽副黏病毒1型的分离鉴定

从呼吸困难、肠道粘膜出血、胰腺大量白色坏死点为特征的7日龄病死雏番鸭的肝脏中分离到1株病毒。经电镜观察发现该病毒为多形性有囊膜病毒,表面有呈辐射状分布的纤突;血清学鉴定表明,能在4℃下凝集鸡和鸽红细胞,其血凝活性能被NDV标准阳性血清特异性抑制。该病毒对10日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)和平均致死时间(MDT)分别为10-8.5/0.1 mL和63.2 h,对番鸭胚成纤维细胞的TC ID50为10-6.32/0.1 mL。经静脉和腿部肌肉两种途径分别接种10日龄雏番鸭和非免疫雏鸡,均可引起发病死亡,并从死亡雏番鸭和雏鸡中可回收到原攻击病毒。依据以上结果表明所分离病毒为中等偏强毒力的禽副黏病毒1型。

鸽副黏病毒1型的分离与鉴定

用SPF鸡胚从疑似鸽新城疫病鸽群中分离到1株病毒,该病毒株能凝集鸡红细胞,该凝集作用能被抗新城疫病毒阳性血清抑制。分离株经肌肉注射能使鸽发病和死亡,出现与自然发病鸽一致的症状和病变。收集发病鸽的病料再进行鸡胚增殖,又重新分离到此病毒。对该分离株进行理化特性研究,血凝素热稳定指数为10,病毒对氯仿、乙醚、胰蛋白酶、盐酸(pH5.0)敏感,0.1%甲醛溶液能完全灭活病毒。对该分离株进行毒力测定,鸡胚平均死亡时间为70.8h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数1.60。结果表明,分离株为中等毒力鸽Ⅰ型副黏病毒。

雏番鸭基因IX型禽1型副黏病毒分离鉴定及F基因序列分析

自发病死亡雏番鸭中分离到一株（XBT14株）基因Ⅸ型禽1型副黏病毒,该病毒可引起雏鸭明显神经症状及急性死亡,致死率达44.4%;病毒融合（F）蛋白裂解位点处具有强毒株特有的多碱性氨基酸序列（112RRQRR↓F117）,与Gen Bank数据库中已发布的基因IX型毒株核苷酸序列同源性高达99.7%-99.9%,与基因VII型毒株核苷酸序列同源性为85.5%-86.6%。该分离株与近来报道的GD09-2等基因IX型毒株处于同一进化分支。以上结果表明对水禽致死性的禽1型副黏病毒呈现基因型多样性,水禽禽1型副黏病毒病的防控日益严峻。

广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

【目的】了解广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的流行特征、毒力强弱及基因类型,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。【方法】采集疑似发病猪组织病料,通过鸡胚接种传代分离病毒后,分别进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、平均死亡时间(MDT)和脑内接种致死指数(ICPI)测定,然后运用RT-PCR对分离株进行鉴定及扩增部分F基因片段,并对扩增片段进行克隆测序及比对分析。【结果】从广西疑似发病猪组织中分离获得一株猪源禽I型副粘病毒,其HA、HI效价均为26,鸡胚最小致死量为10-8/0.1mL,MDT为60h,ICPI为1.45;分离株F基因112～117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与NDV标准强毒株HER33、F48E9的裂解位点一致;同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株F48E9、中等毒力代表毒株BeaudetteC的核苷酸同源性分别为86.5%和85.7%,其推导氨基酸同源性分别为90.1%和90.8%。【结论】猪源禽Ⅰ型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅱ型,是传统型毒株,广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。

一株鸽源Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定和F基因序列分析

为了研究山西地区鸽源Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)的遗传进化规律,试验通过采集疑似病鸽临床病料,经SPF鸡胚传代分离病毒,采用血凝试验和RT-PCR对分离株进行鉴定,扩增分离株F基因部分片段进行同源性分析,并通过病毒毒力测定试验和动物回归试验评价分离株的毒力和致病性。结果表明:从发病鸽群中分离鉴定1株PPMV-1,命名为PPMV-1-SX-011,分离株F基因裂解位点氨基酸序列为^(112)RRQKRF^(117),具有新城疫病毒(NDV)强毒株的典型分子特征;分离株PPMV-1-SX-011与国内流行株Pi/CH/LN/2017、Pi/SH/CH/0168/2013、Pigeon/China/BJ2013、pigeon/China/SDS/2011在遗传进化树上处于同一分支,其中与Pi/SH/CH/0168/2013、pigeon/China/SDS/2011的核苷酸序列同源性高达98.1%和97.7%,属于ClassⅡ基因Ⅵb型;但是与经典疫苗株La Sota、B1、Clone30和Mukteswar株的同源性仅为82.7%~84.5%。分离株PPMV-1-SX-011最小致死量致死鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)值分别为105.6 h、0.3和0。分离株能引起试验鸡和试验鸽体内的免疫应答反应;对试验鸽的致病力强,而对试验鸡无致病力,表明分离株对鸽有特殊亲嗜性。说明本研究分离得到一株鸽源PPMV-1,其具有NDV强毒株裂解位点,对鸡的致病力却与传统NDV存在明显差异,提示山西地区存在对鸽具有强致病性的NDV弱毒株的基因变异株。

鸽新城疫病毒的分离、鉴定和形态观察

从以神经症状为主,有很高传染性和死亡率的病鸽中分离到1株病毒,分离株对鸽有致病性,病死鸽的脑、肝组织悬液及毒株的鸡胚传代材料能凝集鸡红血球,用禽Ⅰ型副粘病毒抗血清,由血凝抑制试验得知该病毒是禽Ⅰ型副粘病毒,用差速离心方法处理增殖病毒的鸡胚尿囊液,可得纯度较高的病毒提纯物,负染后,由电镜观察可见病毒呈多形态,一般为圆形,直径约100～200nm,有“鲱鱼骨”状核衣壳,外被约10nm厚的囊膜,上有整齐排列的8～9nm的纤突。

一株广西鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及F基因序列分析

为了确定鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)分离株的基因型及遗传变异,试验对广西某鸽场疑似感染PPMV-1的临床样品进行RT-PCR诊断、病毒分离鉴定和人工感染试验,并对分离株进行F基因测序、相似性分析及构建遗传进化树。结果表明:临床样品经RT-PCR扩增可得到特异性目的条带,病毒分离株具有血凝活性并能被特异性新城疫(ND)阳性血清抑制。分离株能引起非免疫鸽发病,发病率和死亡率分别为100%和10%。对分离得到的PPMV-1(命名为pi/CH/GX1026/2016)进行序列分析,该分离株F蛋白的裂解位点为^112RRQKR↓F^117,符合新城疫病毒(NDV)强毒株的特征。pi/CH/GX1026/2016分离株与毒株Grey heron/Ch/GD/GZ333/2015和European turtle dove/Ch/GD/GZ23/2015核苷酸和氨基酸相似性较高,核苷酸相似性分别是99.6%和99.4%,氨基酸相似性分别是99.3%和98.9%;与疫苗株La Sota核苷酸和氨基酸相似性较低,分别是83.8%和88.3%。分离株与基因Ⅵ型NDV毒株Grey heron/Ch/GD/GZ333/2015和European turtle dove/Ch/GD/GZ23/2015遗传关系亲近,与基因Ⅱ型疫苗株La Sota的遗传关系较远。说明pi/CH/GX1026/2016分离株为基因Ⅵ型的PPMV-1,该毒株与NDV常用疫苗株La Sota的遗传关系较远。

2019年广西鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及F基因分子进化分析

为了解广西鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1)分离株的基因亚型及遗传进化,2019年从广西鸽场疑似感染PPMV-1的送检临床样品进行病毒分离和鉴定,并对其进行F基因的测序以及系统发育和分子钟的分析。结果显示,从送检样品分离3株病毒株,分别命名为Pi/CH/GX1101/2019,Pi/CH/GX1201/2019和Pi/CH/GX1202/2019。测序结果表明其F基因编码区长度均为1662核苷酸(nt),编码553氨基酸(aa)。分离株的F蛋白裂解位点为^(112)RRQKRF^(117),符合强毒株特征;系统发育分析表明3株毒株属于两个基因亚型:Ⅵ.2.1.1.2.1亚型(原Ⅵj)和Ⅵ.2.1.1.2.2亚型(原Ⅵk);分子钟分析结果显示中国Ⅵ.2.1.1.2.1亚型和Ⅵ.2.1.1.2.2亚型毒株大约在20世纪80年代开始出现进化分歧;Ⅵ.2.1.1.2.1亚型的Pi/CH/GX1201/2019和Pi/CH/GX1202/2019与位于进化枝低节点的野鸟源参考毒株W4的亲缘关系较近,同在一个分支中,而Ⅵ.2.1.1.2.2亚型的Pi/CH/GX1101/2019毒株与进化枝低节点的2株野鸟源参考毒株Grey heron/CH/GD/GZ333/2015和European turtle dove/CH/GD/GZ23/2015的亲缘关系相近,同在一个小簇中。研究结果证明广西鸽群主要流行Ⅵ.2.1.1.2.1亚型和Ⅵ.2.1.1.2.2亚型的PPMV-1,并推测存在从野鸟传入商业鸽群的风险。