axl基因在骨髓增生异常综合征患者外周血细胞的表达

为研究axl基因在骨髓增生异常综合征(MDS)及其它几种血液病患者外周血单个核细胞中的表达,用RT-PCR方法测定细胞中axl基因mRNA的表达情况。结果表明:①10/11例(91%)MDS患者和1/2例AML-M_3型患者有axl基因表达。2例再生障碍性贫血患者、2例球形红细胞增多症患者、2例正常人均无axl基因表达。②FAB分型与axl基因表达关系:5例RA有表达,其中强表达2例,弱表达3例;4例RAEB均有表达,其中强表达1例,弱表达3例;1例RAEB-T为强表达。以上结果说明,axl基因在MDS患者中有很高的表达率,提示其可能作为MDS患者的诊断指标之一。

AXL基因在骨髓增生异常综合征外周血单个核细胞中的表达

目的 探讨AXL基因在正常人、骨髓增生异常综合征 (MDS)及其他血液病患者外周血单个核细胞中的表达情况。方法 采用RT PCR法。结果 ①AXL基因在 10例正常人外周血单个核细胞中不表达 ,正常骨髓单个核细胞中有表达。② 5 0例MDS患者的外周血单个核细胞中有 4 1例 (82 % )AXL基因阳性。FAB亚型与AXL表达关系 :3 5例难治性贫血 (RA)者中 2 7例阳性 ,3例环形铁粒幼细胞性难治性贫血 (RAS)阳性 ;9例难治性贫血伴过多母细胞 (RAEB)者中 8例阳性 ,3例难治性贫血伴过多母细胞伴有转化 (RAEB T)患者均阳性。 6例实验时临床不能确诊为MDS者AXL基因阳性 ,经随访骨髓转为MDS ;3例骨髓疑为MDS或诊为MDS者AXL基因阴性 ,经随访确诊为其他疾病。③ 12例再生障碍性贫血 (AA)、1例缺铁性贫血 (IA)、1例溶血性贫血、2例夜间阵发性血红蛋白尿 (PNH)、3例特发性血小板减少性紫癜 (ITP)患者的AXL均阴性。

Axl基因在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

目的检测Axl(Anexelekto)在口腔鳞状细胞癌中的表达,探索Axl与口腔鳞状细胞癌发生、发展的关系。方法免疫组织化学法(IHC)检测42例口腔鳞状细胞癌患者的癌组织(口腔癌组)及其相应的癌旁组织(癌旁组)Axl的表达状况。原代培养正常人口腔上皮细胞(HOEC),并培养1株永生化正常口腔角化上皮细胞系(NOK)及2株人舌鳞状细胞癌细胞系(UM1、UM2)。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测上述4种细胞中的Axl的mRNA和蛋白的表达情况。结果 Axl在口腔鳞状细胞癌组织中的阳性表达率(61.9%)高于其相应的癌旁正常组织(26.2%),差异具有统计学意义(P<0.05),qRT-PCR和Western blot结果示在HOEC、NOK、UM2、UM1中Axl基因的mRNA表达和蛋白表达逐步增高,且在UM2、UM1中明显高于HOEC、NOK。结论 Axl在口腔癌组织及口腔癌细胞株中的表达较口腔正常组织和正常口腔上皮细胞者中高表达,提示Axl基因可能与口腔鳞状细胞癌的发生、发展相关。

Tyro 3和Axl基因真核表达载体的构建

目的为了构建可在真核细胞中高效表达Tyro3和Axl的真核表达质粒,以便用于自身免疫性疾病的研究。方法采用基因重组技术构建,从Gen Bank中获取小鼠Tyro3和Axl mRNA序列,构建目的基因重组真核表达质粒,并利用双酶切及测序鉴定重组质粒;质粒DNA转染RAW264.7小鼠巨噬细胞。结果酶切和测序鉴定证实目的基因Tyro3和Axl正确插入到真核表达载体pEGFP-N1中,在荧光显微镜下观察到转染RAW264.7小鼠巨噬细胞绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了可在真核细胞中高效表达Tyro3和Axl基因的真核表达质粒pEGFP-N1-Tyro3、pEGFP-N1-Axl。

受体酪氨酸激酶AXL影响新城疫病毒复制及干扰素刺激基因产生的研究

受体酪氨酸激酶AXL是TAM家族(由TYRO3、AXL和MERTK组成)的成员之一,在机体的许多生理和病理条件下发挥重要作用。为探究AXL对新城疫病毒(NDV)复制及干扰素刺激基因(ISGs)产生的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计了2条AXL的sgRNA和1条阴性对照sgRNA,并分别插入LentiCRISPRv2中构建LentiCRISPRv2-AXL-1、LentiCRISPRv2-AXL-2及阴性对照质粒LentiCRISPRv2-AXL-control,并经菌液PCR和测序鉴定正确后分别与pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞,获得相应重组慢病毒,分别命名为rLenti-AXL1、rLentiAXL2和rLenti-control。同时筛选药物Puromycin对DF-1细胞的最佳使用浓度;将上述慢病毒分别感染DF-1细胞,48 h后利用qPCR检测sgRNA的敲低效果;将敲低效率较高的重组慢病毒感染DF-1细胞,并经最适浓度的Puromycin筛选和亚克隆纯化后获得的细胞分别经qPCR和western blot检测AXL基因及其蛋白水平;将获得的细胞连续传10代后分别取第2、4、6、8、10代细胞经qPCR检测其遗传稳定性。结果显示,2.5μg/mL为Puromycin的最适筛选浓度;qPCR结果显示,rLenti-AXL1和rLenti-AXL2均能敲低DF-1细胞中的AXL基因水平,但后者的敲低效率较高,因此选择rLenti-AXL2进行后续试验;经Puromycin筛选细胞3次后经亚克隆纯化,获得了3株敲低AXL基因的细胞;细胞的qPCR和western blot结果显示,3株细胞中AXL基因及蛋白表达水平均极显著降低;遗传稳定性结果显示,各代细胞中AXL基因的转录水平仍然较低。上述结果表明,获得了敲低AXL基因表达的DF-1细胞系,命名为AXL-KD DF-1细胞。将MOI 1的NDV分别感染DF-1和AXL-KD DF-1细胞后,分别经qPCR和western blot检测Mx1和IFIT5基因的转录水平及细胞中NDV NP蛋白水平。结果显示:无论是否感染NDV,AXL-KD DF-1细胞中Mx1和IFIT5基因的转录水平均显著升高1倍左右(p<0.05);且相比于DF-1细胞,感染NDV的AXL-KD DF-1细胞中NP蛋白的表达量均极显著下降(p<0.0001)。综上结果表明,敲低细胞中的AXL基因后能够抑制NDV复制并且促进Mx1和IFIT5转录水平的显著上调,本研究为了解NDV的致病机制奠定基础。

前列腺癌细胞和组织中Axl及其配体蛋白的表达与临床意义

目的:探讨受体酪氨酸激酶Axl及其配体Gas6蛋白在前列腺癌细胞系和前列腺癌组织中的表达及其与前列腺癌病理特征的关系。方法:收集自2007年-2008年在第二军医大学长海医院泌尿外科接受手术或病理穿刺的前列腺癌组织标本45例和良性前列腺增生组织标本32例。Western blotting分析前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3及DU-145中Axl及其配体Gas6的表达;免疫组化方法检测前列腺癌及良性前列腺增生组织中Axl及其配体Gas6的表达。结果:Western blotting检测结果显示,高侵袭性前列腺癌细胞DU-145和PC-3中Axl的表达显著强于低侵袭性细胞LNCaP,Gas6的表达在3个细胞系中无明显差异。免疫组化结果显示,前列腺癌组织中Axl蛋白强阳性表达显著高于良性前列腺增生组织(68.9%vs21.9%,P<0.01);前者Gas6蛋白的表达也显著高于后者(53.3%vs15.6%,P<0.01)。前列腺癌组织中,Axl和Gas6蛋白的强阳性表达与Gleason评分及远处转移密切相关(P<0.05)。结论:前列腺癌组织中Axl和Gas6高表达,该两者的表达与前列腺癌恶性程度及肿瘤转移密切相关。

Axl和Mer受体调控小鼠红细胞分化

目的研究Axl和Mer受体是否参与红细胞分化的调控。方法单基因(AXL-/-和MER-/-)和双基因(AXL-/-MER-/-)敲除小鼠,利用组织切片观察小鼠骨髓、肝脏和脾脏的组织结构;计数小鼠单根股骨内骨髓细胞的数量;用实时定量PCR检测与红细胞分化相关基因mRNA的表达。结果双基因敲除的小鼠单根股骨骨髓内总细胞、单个核细胞和成熟红细胞的数量分别下降了40%、34%和53%(P<0.01);骨髓细胞排列稀疏,血窦内、外成熟红细胞数量明显减少;虽然外周血中红细胞数量和血红蛋白的含量没有改变,但存在着明显的髓外造血,肝脏里出现了造血岛,脾脏中红髓明显地增生。而单基因敲除小鼠骨髓中红细胞数量以及组织结构未见改变。且双基因敲除小鼠中红系细胞内GATA-1和EpoR的mRNA表达分别降低了65%和75%(P<0.01)。结论 Axl和Mer受体通过GATA-1和EpoR来调节红细胞的分化,并且功能上存在重叠、过剩和代偿。

受体酪氨酸激酶Axl调控糖蛋白Ⅵ介导的血小板活化

目的研究生长静止特异性基因6的受体Axl对胶原蛋白受体糖蛋白Ⅵ介导的血小板活化的调控作用。方法利用Axl基因敲除小鼠和糖蛋白Ⅵ特异性刺激剂,在体外分别研究血小板的聚集和铺展功能,并应用流式细胞术检测血小板的颗粒释放和整合素αⅡbβ3的活化。结果与野生型小鼠相比,Axl基因敲除小鼠的血小板聚集和铺展功能受到明显抑制;流式细胞术检测结果表明,Axl敲除的血小板的颗粒释放标记物CD62P的表达明显降低(P<0.05),整合素αⅡbβ3的活化同样受到明显抑制(P<0.05)。结论生长静止特异性基因6的受体Axl在糖蛋白Ⅵ介导的血小板活化中发挥重要的调控作用。

SARS-CoV-2受体基因Ace2和Axl在小鼠多种组织中定位与表达

目的采用原位杂交技术分析正常生理、病毒感染、细菌感染条件下介导SARS-CoV-2进入细胞的受体基因Ace2、Axl在小鼠多种组织中的定位及表达情况,为COVID-19相关研究提供理论依据。方法21只雄性C57BL/6小鼠,其中3只经麻醉、心脏灌注后获取骨骼肌、心、肝、脑、肺、肾、舌、胃、小肠、大肠、皮肤、鼻腔组织,采用原位杂交技术检测Ace2、Axl mRNA定位及表达情况。其余18只小鼠分为病毒感染组、细菌感染组、对照组各6只,病毒感染组分别于第1、3、5天腹腔注射1g/L Poly(I:C)0.2mg,制备病毒感染小鼠模型;细菌感染组分别于第1、3、5天腹腔注射0.1g/L脂多糖0.02mg,制备细菌感染小鼠模型;对照组注射等体积PBS。于第6天(末次注射后24h)对3组小鼠麻醉、心脏灌注后获取各部位组织,采用原位杂交技术检测Ace2、Axl mRNA定位及表达情况。结果Ace2mRNA在骨骼肌、胃、肝脏、大脑皮层组织无表达,在胆管细胞及肺、大肠组织低表达,在鼻腔上皮、肾脏、心脏、舌、皮肤、小肠上皮组织及脑室周围神经前体细胞高表达;Axl mRNA几乎在所有被检测组织中均高表达。细菌感染组心脏组织Ace2mRNA阳性细胞数[(733±107)个/mm^(2)]高于病毒感染组[(369±99)个/mm^(2)]、对照组[(320±107)个/mm^(2)](P<0.05),病毒感染组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);细菌感染组心脏、骨骼肌组织Axl mRNA阳性细胞数[(2026±255)、(530±65)个/mm^(2)]均高于病毒感染组[(933±112)、(431±50)个/mm^(2)]、对照组[(687±76)、(333±40)个/mm^(2)](P<0.05),病毒感染组均高于对照组(P<0.05);3组小肠组织Ace2、Axl mRNA阳性细胞平均光密度值及肺、肝脏组织Axl mRNA阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论小鼠Ace2主要表达于心脏、毛囊、肾脏、舌、小肠等组织,Axl广泛表达于各种组织;细菌感染时心脏组织Ace2、Axl及骨骼肌组织Axl表达上调,病毒感染时心脏、骨骼肌组织Axl表达上调。