Azocasein法测定嗜冷菌耐热胞外蛋白酶活性研究

人工底物偶氮酪蛋白(azocasein)在酶的作用下释放发色团,通过分光光度法可以定量嗜冷菌蛋白酶活性。经波长扫描,确定发色物质最大吸收波长为345nm。通过单因素试验,表明试验的最佳参数为:底物与酶反应时间2h,TCA质量分数为12%,TCA终止反应后溶液静止时间30min;该方法在一定浓度范围内线形关系良好(R2=0.9913),样本标准差为8.3×10-4～1.4×10-3,变异系数为0.21%～0.54%,检测限为1.33U/mL;通过对UHT中嗜冷菌蛋白酶活性测定,表明酶活性随温度升高、培养时间延长而增加。

谷氨酰内切酶的原核表达及生物化学特性分析

目的原核表达谷氨酰内切酶,评价其生物化学特性。方法 PQE60Glu△Cmut5质粒转化大肠埃希菌M15,经异丙基β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导、Ni-NTA亲和层析等步骤获得重组谷氨酰内切酶。以偶氮酪蛋白为底物测定其酶活性,分析底物浓度、温度、pH、金属离子和EDTA对酶活性的影响。采用SDS-PAGE电泳和质谱研究谷氨酰内切酶对Hb的酶解作用。结果重组谷氨酰内切酶可以在M15菌中高效表达,并具有较高的酶活性。SDS-PAGE分析显示其相对分子质量约33 000。谷氨酰内切酶的Km值为0.26 mmol/L,最适反应温度为55℃,最适pH为8.0,Ca2+和Mg2+能激活酶活性,Fe2+、Zn2+、Mn2+和EDTA则对酶活性有抑制作用。SDS-PAGE和质谱分析显示重组谷氨酰内切酶对Hb有特异性水解作用。结论谷氨酰内切酶在大肠埃希菌M15中能获得高效表达,具有特有的生物化学特性和严格的底物水解特异性。