bFGF单克隆抗体抑制小鼠Lewis肺癌转移及血管新生

背景与目的:碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种具有广泛生物学功能的细胞因子,在肺癌等多种肿瘤组织高表达,并参与其发生、发展进程。本研究旨在探讨bFGF单克隆抗体对C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移及血管新生的抑制作用。方法:采用皮下接种肿瘤细胞的方法,建立Lewis肺癌自发转移小鼠模型,随机分为PBS组、bFGF单克隆抗体MabF7治疗组,以及正常小鼠IgG阴性对照组,每组8只。自接种第9天开始给药,每3天1次,连续6次。同时观察Lewis肺癌小鼠健康状况,游标卡尺测量皮下移植瘤体积,给药6次后处死小鼠,称瘤质量,取肺组织计数各组小鼠肺表面转移瘤结节数,并用免疫组化法检测CD31的表达,以计算肿瘤组织微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:MabF7治疗组小鼠肿瘤体积与PBS组相比生长缓慢,小鼠瘤质量为(2.6±1.0)g,较PBS组的(5.1±1.3)g显著降低(P<0.05);MabF7组小鼠肺表面转移瘤结节数为(3.0±2.1)个,显著低于PBS组的(12.3±2.4)个(P<0.05)。另外MabF7组可显著抑制肿瘤组织MVD表达水平。结论:bFGF单抗可明显抑制C57BL/6小鼠Lewis肺癌生长及转移,其作用与抑制肿瘤增殖及微血管生成相关。

靶向bFGF与FGFR1Ⅲc结合位点的单克隆抗体制备及其生物学活性研究

目的针对碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)与成纤维生长因子受体1c(FGFR1Ⅲc)的结合位点,制备鼠抗人b FGF单克隆抗体并研究其生物学活性。方法用重组表达的人b FGF免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾脏常规融合制备杂交瘤细胞,通过间接和竞争ELISA筛选出与FGFR1Ⅲc有共同结合位点的抗b FGF单抗。制备小鼠腹水并利用Protein G亲和柱纯化腹水单抗,SDSPAGE鉴定纯化产物;间接ELISA测定单抗亚类、亲和常数,竞争ELISA测定抗体IC50;Western blot和免疫荧光对单抗的生物学活性初步鉴定;CCK-8法检测单抗对肺癌细胞株LL/2的增殖抑制活性。结果筛选出了2株稳定表达b FGF抗体的细胞株Mab E12和Mab D9,竞争ELISA测得其IC50分别为1.564和1.96μg/ml,免疫球蛋白分类两者均为Ig G1,间接ELISA测得Mab E12的亲和常数为5.66×108L/mol;Western blot和免疫荧光表明该抗体能与LL/2细胞内天然合成的b FGF相结合,并对其增殖产生了较明显的抑制作用。结论成功建立了1株能特异性识别b FGF-FGFR1Ⅲc合位点的单抗,能有效的中和b FGF对肺癌细胞株LL/2促增殖作用,为研究肿瘤治疗途径奠定了基础。

bFGF单抗联合放疗对小鼠B16移植瘤的协同抑制作用

目的:探讨碱性成纤维细胞因子单克隆抗体(basic fibroblast growth factor monoclonal antibody,bFGF-mAb)联合放疗对小鼠B16移植瘤的抑制效应。方法:制备并提纯小鼠bFGF-mAb,建立荷B16黑素瘤小鼠模型并随机分为对照组、放疗组、bFGF-mAb组及联合治疗组。各组经相应治疗后,测量移植瘤体积;治疗20 d后处死小鼠,取移植瘤称瘤质量,计算抑瘤率。TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡率,免疫组化检测移植瘤组织bFGF、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达率及肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:bFGF-mAb治疗、放疗、联合治疗的抑瘤率分别为30.49%、12.17%和48.76%,联合治疗组的抑瘤率明显高于其他组(P<0.05);与放疗组比较,联合治疗组的放射增敏率为2.37。联合治疗组移植瘤细胞凋亡较放疗组、bFGF-mAb组及对照组明显增多[(58.56±6.47)%vs(17.21±2.86)%,(28.45±5.47)%,(10.62±1.73)%;P<0.05或P<0.01],其bFGF、VEGF表达水平下降,MVD明显减少(P<0.05)。结论:bFGF-mAb联合放疗对B16移植瘤具有协同抑瘤效应,通过降低肿瘤组织bFGF和VEGF表达、抑制血管新生、促进瘤细胞凋亡提高放疗敏感性。

bFGF单抗协同替吉奥抑制肺癌Lewis细胞的增殖及移植瘤血管新生

目的:探讨碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)单抗与替吉奥(gimeracil and oteracil porassi-um,又称S-1)联合应用体内外抑制小鼠Lewis肺癌细胞增殖、移植瘤生长及转移、肿瘤血管新生的协同作用。方法:CCK-8法检测bFGF单抗及S-1对Lewis细胞增殖的抑制作用。建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌自发转移瘤模型,32只小鼠随机分成生理盐水(NS)组、bFGF单抗组、S-1组和bFGF单抗+S-1组,每组8只;测量瘤体,绘制生长曲线,称瘤质量并计算抑瘤率;计数各组肺表面转移瘤结节;CD31标记血管内皮细胞,计数转移瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:bFGF单抗、S-1剂量依赖性抑制Lewis细胞增殖(P<0.05),联合用药组抑制率明显高于单药组(P<0.05或P<0.01)。bFGF单抗组、S-1组以及bFGF单抗+S-1组对Lewis转移瘤的抑瘤率分别为37.8%、47.7%、65.9%,联合组抑瘤率明显高于单药组(P<0.05或P<0.01)。联合组肺表面转移结节、微血管密度明显低于单药组(2.71±0.76vs6.57±0.98、4.71±0.76;21.6±2.9vs33.4±4.9、41.9±6.3;P<0.05或P<0.01)。结论:bFGF单抗联合S-1对Lewis肺癌移植瘤具有协同抑制作用,其机制与抑制细胞增殖及血管新生有关。

bFGF单克隆抗体对卵巢癌移植瘤血管生成的抑制作用

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在卵巢上皮性肿瘤中的表达强度与肿瘤血管生成之间的关系,及其单克隆抗体bFGFMAb对人卵巢癌移植瘤血管生成和肿瘤生长的影响。方法:(1)应用免疫组化法和图像分析系统研究bFGF在正常卵巢组织,良性、交界性和恶性卵巢上皮性肿瘤中的表达部位和强度;以及bFGF的表达强度与肿瘤新生血管的关系;(2)利用卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,每周2次将不同浓度的bFGFMAb注射于瘤体周围,连续8周,每周测量肿瘤体积,绘制移植瘤生长曲线;对移植瘤组织行Ⅷ因子的免疫组化染色,测定肿瘤内微血管密度(MVD)。结果:(1)bFGF主要在卵巢上皮性肿瘤细胞浆内表达,在交界性和恶性肿瘤中,部分细胞同时存在核表达;bFGF在正常卵巢组织,良性、交界性和恶性卵巢上皮性肿瘤中的表达强度逐步增强,同时MVD逐步增高,二者呈正相关(P<0.001);(2)30、20、10μgbFGFMAb组移植瘤体积分别是对照组的31.34%、49.20%和71.25%,MVD分别是对照组的27.80%、52.37%和81.86%(P<0.05),其作用呈浓度依赖性。结论:bFGFMAb能明显抑制卵巢癌的血管生成和肿瘤生长,有望成为卵巢癌生物治疗的新方法。

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的:从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区(V)基因,构建bFGF单链抗体(scFv),并进行可溶性表达。方法:从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链的可变区基因(VL);再通过重叠延伸拼接(SOE)PCR方法,在VH和VL基因之间引入linker(Gly4Ser)3,构建bFGFscFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB5E中,选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达;经SDS-PAGE检测抗体表达水平,ELISA鉴定其抗原结合活性。结果:测序分析结果显示,VH基因序列全长375碱基对,编码125个氨基酸,VL基因序列全长399碱基对,编码133个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基;构建的scFv全长789碱基对,编码263个氨基酸,连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,表达产物的Mr为27000,与理论预期值相符;间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论:成功地克隆bFGF mAb可变区基因,并构建表达bFGF scFv,为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。

bFGF单抗的抗血管新生作用

目的在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及鸡胚中来研究抗碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单抗对血管新生的作用。方法制备3种腹水型bFGF单抗MabF7,MabF10,MabF12。CCK-8法检测bFGF单抗对HUVECs细胞增殖的影响;Transwell小室研究bFGF单抗对HUVECs迁移的影响;ECM gel检测其对HUVEC体外成管的影响;并研究其体内对鸡胚尿囊膜(CAM)血管新生作用。结果 MabF7,MabF10,MabF12均可中和bFGF的活性;3株单抗均可抑制内皮细胞迁移过程,无抗体组,对照抗体组,MabF7,MabF10,MabF12组细胞迁移率分别为100%,106.25%±7.89%,69.50%±6.86%,74.00%±4.16%,67.75%±3.30%;3株单抗均可抑制内皮细胞成管过程,无抗体组,对照抗体组,MabF7,MabF10,MabF12组管状结构形成率分别为:100%,105.93%±3.85%,56.53%±4.35%,29.23%±6.45%,12.77%±2.67%;计数尿囊膜上加药滤纸周围呈放射状的血管条数,bFGF组,bFGF+MabF7组,bFGF+MabF10组,bFGF+MabF12呈放射状的血管条数分别为15±0.82,7.5±1.29,13.5±3.10,8.5±0.58。结论 bFGF单抗对HUVECs的增殖、迁移、成管以及鸡胚尿囊膜血管新生均有抑制作用,从而为具有抗肿瘤作用的抗体药物的研发奠定基础。

bFGF单抗联合紫杉醇抑制MCF-7及MCF-7紫杉醇耐药株(MCF-7/Taxol)增效作用的分子机制

目的研究bFGF单抗联合紫杉醇（Taxol）抑制MCF-7细胞增殖、诱导细胞凋亡的分子机制;探讨bFGF单抗联合Taxol对耐药株MCF-7/Taxol的增效作用及机制。方法 CCK-8法检测bFGF单抗联合Taxol对MCF-7及MCF-7/Taxol增殖抑制率;流式细胞术检测二者联合对MCF-7、MCF-7/Taxol的凋亡作用;Western blot检测MCF-7及MCF-7/Taxol相关信号通路蛋白的表达变化。结果 CCK-8法检测结果显示bFGF单抗联合Taxol作用MCF-7、MCF-7/Taxol后对其增殖抑制率分别提高了13.40%~36.50%、9.56%~26.87%,联合能加强对细胞抑制作用。流式细胞术结果显示bFGF单抗联合Taxol作用MCF-7、MCF-7/Taxol后PI、FITC双阳性率分别提高了17.10%~23.20%、22.00%~22.70%,表明联合能加强对凋亡作用。Western blot结果显示MCF-7、MCF-7/Taxol中MabD9＋Taxol组能明显下调Raf-1、p-Erk、p-STAT3、Bcl-2、Caspase3,并上调p-JNK、Bax、cleavedCaspase3、cleaved PARP,其中Raf-1在MCF-7/Taxol中表达量较MCF-7明显下降。结论本研究揭示了bFGF单抗联合Taxol抑制MCF-7的如下机制：加强对Erk/MAPK通路的抑制,并加强上调p-JNK,下调p-STAT3的表达量,引起Bcl-2表达量下调,Bax表达上调,Caspase3、cleaved Caspase3、cleaved PARP表达变化引起细胞凋亡。且耐药株除具类似的抑制机制外,其Raf-1下调更加明显。

碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体ELISA微量检测技术

目的:用本室制备的单克隆抗体建立间接ELISA检测微量bFGF的技术。方法:将抗重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的杂交瘤细胞株,经再克隆化,选择高亲和力的抗bFGF杂交瘤细胞2H2。用ProteinA亲和层析法对2H2腹水型单抗进行纯化。结果:用2H2mAb建立了高灵敏度的间接、竞争ELISA检测bFGF方法,灵敏度分别达到10和1.0pg/孔,并用间接ELISA检测神经胶质瘤细胞SWO38上清中的bFGF含量。结论:为实验研究和临床应用提供了微量bFGF的检测方法。

碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体联合洛铂对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体(monoclonal antibody to basic fibroblast growth factor,b FGF m Ab)联合洛铂(lobaplatin,LBP)对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法:CCK-8法检测药物对A549细胞活性的影响。Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率。激光共聚焦显微镜观察细胞核的形态。Western blotting检测细胞内凋亡相关蛋白表达。结果:CCK-8法检测结果显示,细胞培养48 h后,bFGF mAb组和LBP组的细胞增殖受到抑制,但两药联用后的增殖抑制作用明显高于单用LBP及bFGF mAb(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI结果显示,联合组早期、晚期凋亡率分别为(27.83±1.23)%和(39.32±1.01)%,与b FGF mAb的(6.25±0.19)%、(14.54±0.25)%和LBP的(16.54±0.39)%、(21.02±0.98)%相比,明显高于单药组的抑制率(P<0.01)。激光共聚焦显微镜显示联合用药诱导的细胞核裂解率较单用b FGF m Ab及LBP的细胞核裂解率明显增多。Western blotting检测结果显示联合组BAX、Caspase-3、Caspase-9、PARP表达量较药物单用组明显增加,而Bcl-2、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、cleaved-PARP表达量明显降低。结论:b FGF m Ab联合LBP通过抑制Bcl-2、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、cleaved-PARP表达,上调BAX、Caspase-3、Caspase-9和PARP蛋白表达,对肺腺癌A549细胞起到抑制增殖和诱导凋亡的作用。

碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体在小鼠体内药代动力学研究

目的研究碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体(basic fibroblast growth factor monoclonal antibody,bFGF-mAb)在小鼠体内的药代动力学特征。方法首先制备bF-GF-mAb并纯化,然后用氯胺T法制备125I-bFGF-mAb,γ放射免疫计数仪检测三氯醋酸(TCA)沉淀前后血浆、组织的放射性计数,用3P97软件拟合药代动力学房室模型,并计算相应药代动力学参数。结果氯胺T法制备的125I-bFGF-mAb,其放化纯度≥98%,TCA沉淀率(90.8±10.2)%。T12α为0.1～0.2 h,T12β为1.05～1.84 h和T 12γ为81.6～90.3 h。125 I-bFGF-mAb在小鼠的心、肝、肺等组织器官中有较高的放射性计数,在脑和眼中放射性计数较低。结论 125I-bFGF-mAb的药代动力学符合三室模型,且具有组织分布特异性。