海洋细菌Bacillus cereus OPF-0031产普鲁兰酶的发酵条件优化研究

利用响应面法对海洋细菌Bacillus cereus OPF-0031产普鲁兰酶发酵条件进行优化。在单因素实验基础上,首先通过两水平的PB(Plackett-Burman design)设计筛选出影响普鲁兰酶发酵的四个显著因素:硫酸铵、硫酸镁、硫酸铁、糯米粉;通过4因素4水平的响应面二次回归中心组合实验(central composite design,CCD)对上述影响因素进行优化。实验结果运用Design-Expert软件进行回归分析,最终确定最佳的培养条件:糯米粉15.53 g/L,硫酸铵9 g/L,硫酸镁0.9 g/L,硫酸铁0.018 g/L,蛋白胨10 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L反应温度为30℃,转速为180 r/min,最终酶活可达到2.7742 U/mL。

普鲁兰酶产生菌的筛选及诱变技术研究

从土壤中筛选出1株普鲁兰酶产生菌,经过紫外线诱变及紫外线—甲基磺酸乙酯复合诱变后,从大量突变株中筛选出1株稳定产普鲁兰酶的菌株。诱变育种最佳条件为紫外线照射时间2 min,菌浓度104;甲基磺酸乙酯(体积分数10 mL/L)处理50 min。酶活力由出发菌的2.06 U/mL提高到9.37 U/mL,比国内报道的最高值8.8 U/mL高出0.57 U/mL。

枯草芽孢杆菌工程菌株产普鲁兰酶发酵条件的优化

利用基因工程手段获得的产长野芽孢杆菌普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株WB600/pWB-pulB,通过单因素筛选及正交试验进行发酵培养基优化,得到产酶最佳配方为玉米淀粉3.0%,酵母膏2.0%,CaCl20.03%,Na2HPO41.0%。同时对重组菌株摇瓶条件下液体发酵的主要影响因素初始pH、接种量、装液量、转速、温度等进行探讨,确定了产酶最佳培养条件为,以3%接种量接种于优化后培养基,初始pH7.0,装液量30 mL/250 mL,37℃,200 r/min摇床培养36 h。在此优化条件下,普鲁兰酶活力达到20.16 U/mL,是之前研究结果(10.94 U/mL)的1.84倍。

红曲黄酒来源芽孢杆菌普鲁兰酶基因克隆和生物信息学分析

红曲黄酒酿造原料为大米,淀粉质量分数在70%以上,微生物来源淀粉酶系对淀粉的水解至关重要,影响甚至决定红曲黄酒酿造的原料转化过程和产品品质。从酒曲中分离具有淀粉水解能力的芽孢杆菌2株,编号BHQ03和BHQ06,进行分子生物学鉴定并分别从2株菌中克隆获得pulL1和pulL2,pulL3和pulL4共4个I型普鲁兰酶基因,其中基因pulL1和pulL3均编码713个氨基酸,序列相似度96.31%,基因pulL2和pulL4均编码852个氨基酸,序列相似度99.77%。对基因pulL1和pulL2编码蛋白PulL1和PulL2进一步分析发现,二者均属于G13家族,具有4段特征性保守区域。PulL2的N-端含有32个氨基酸残基的信号肽序列,且催化活性位点存在突变(D407G)。结合文献研究和三维结构模拟,分析普鲁兰酶的具体催化过程。上述研究为科学解析红曲黄酒酿造的淀粉水解过程提供参考。

微生物法生产普鲁兰酶的研究

对产普鲁兰酶的出发菌株进行筛选和诱变，使酶活从22．10u／ml提高到了40．77u／ml，酶活提高了84．4％。随后对菌体产酶培养基进行了确定和优化，得到最佳发酵培养基，在此培养基下，菌体产酶达46．76u／ml，为原酶活的114．7％。

嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶酶学性质研究

对获得的嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶进行了酶学性质测定.结果表明：普鲁兰酶最适温度为60℃,此温度下处理90min,残存酶活在70%以上,70℃酶的半衰期大于50min;最适pH 5.6,在pH 4.5-6.0的范围50℃保温24h仍具有较高活性;Km为0.036μmol/L,Vmax为20.16μmol/min;Mn^2＋、Mg^2＋和Ca^2＋对酶有激活作用,其中以Mn^2＋的激活作用最强,而Cu^2＋和Zn^2＋则有抑制作用.研究表明嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶是高温酸性酶,对底物有较强亲合力和催化活性,在淀粉糖化工业中有良好的应用前景.

麦芽糖基(α-1→6)β-环糊精的酶法合成和结构鉴定

Cyclodextrins are widely used for various purposes and limited because of it′s low solubility.Branched cyclodextrins have attracted more and more attention because of their many advantages such as higher solubility in water.In this study a new method for synthesizing maltosyl(α-1→6)β-cyclodextrin with a high yield was described.Mal-β-CD was synthesized through the reverse reaction of Bacillus licheniformis pullulanase and identified.The factors which affect the formation of maltosyl(α1→6)β-cyclodextrin were studied and the optimum conditions were obtained as follows: 250 U/g β-CD of enzyme amount,molar ratio of maltose to β-CD 12∶1～16∶1,a substrate mass fraction of 80%,the pH of reaction mixture 4.5,reaction temperature 70 ℃ and reaction time 60 h respectively.The product was separated by Sephadex G25 column and further purified by Bio-gel P-2 column.Maltosyl(α-1→6)β-cyclodextrin was identified by IR,ESI-MS and NMR.It was proved to be a effective method to synthesize maltosyl(α-1→6)β-cyclodextrin by using Bacillus licheniformis pullulanase.The yield of Mal-β-CD was about 56% under the optimal conditions.

嗜热脂肪芽孢杆菌中普鲁兰酶的分离纯化

嗜热脂肪芽孢杆菌经细胞破碎机破壁后,采用硫酸铵盐析法除杂蛋白,DEAE-32阴离子交换纤维素纯化胞内普鲁兰酶,并通过L9(34)正交试验优化盐析除杂蛋白工艺条件.结果表明:菌体与缓冲液比1∶3、硫酸铵饱和度40%、pH值7.0分离效果最佳,其中,pH值对分离效果的影响差异性显著(F>F0.05);纯化后的普鲁兰酶比活力为26.50U/mg,纯化倍数为8.01,回收率为73%;经SDS-PAGE检测,显示一条电泳区带,相对分子质量为55.4ku,表明获得了纯酶.

普鲁兰酶的纯化及其性质

采用ＤＥＡＥ—纤维素柱和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱色谱对从土壤中筛选得到的普鲁兰杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓａｃｉｄｏｐｕｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）菌株所产生的普鲁兰酶（丹麦ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ产品）进行分离纯化。酶活测定的结果表明，该酶的最适催化ｐＨ为４８，最适温度为３８℃，有相当高的热稳定性，米氏常数Ｋｍ为５２ｍｍｏｌ。

产普鲁兰酶芽孢杆菌L5的ARTP诱变育种及发酵优化研究

普鲁兰酶是高效利用淀粉的关键酶之一,选育普鲁兰酶高产菌株对其工业化应用具有重要意义。从土壤中筛选得到一株产普鲁兰酶菌株L5,产酶活力为10.83 U/mL。通过16S rDNA测序和构建系统发育树,鉴定菌株L5为芽孢杆菌菌属(Bacillus genus)。以L5菌株为出发菌株采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行诱变育种,筛选出4株普鲁兰酶高产突变菌株G1(20.33 U/mL)、G2(19.68 U/mL)、G3(19.31 U/mL)、G4(22.01 U/mL),较之前酶活性分别提高了87.7%、81.7%、78.3%、103.2%。利用正交试验优化发酵培养基,最优组合:可溶性淀粉1.5%、糊精1.0%、蛋白胨0.5%、黄豆粉1.5%、Ca^2+0.05%、Fe^2+0.10%、Zn^2+0.15%,在最优发酵培养基条件下,G4菌株产酶活力可达27.22 U/mL(提高了23.7%)。试验所产普鲁兰酶的最适反应温度为50℃、最适反应pH值为6.5,在30~60℃保温2 h酶活能维持在80%以上,在pH 5~9保存4 h后酶活力仍能维持在60%以上,该酶具有良好的热稳定性。

解淀粉芽孢杆菌I型耐热普鲁兰酶的纯化及酶特性分析

对来源于菌株解淀粉芽孢杆菌HxP-21的普鲁兰酶(命名为PulBa)分离纯化,研究其酶学特性,为普鲁兰酶在淀粉加工中的应用提供理论基础。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析从菌株HxP-21发酵液中分离纯化出一种新型的普鲁兰酶。酶的纯化倍数20.8,回收率53.2%,比活力176.5 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得PulBa达到电泳纯,分子质量51.2 kDa。PulBa在45~70℃和pH 3~6范围内具有较高酶活力,最适反应温度55℃、pH 4.5。PulBa有良好的pH值稳定性和热稳定性,40~70℃孵育120 min保留最初活性的80%以上;pH 3~7范围内具有很高的稳定性,孵育6 h后仍保留60 U/mL以上活性。PulBa对各种金属离子和化学试剂表现出不同的敏感性,Mg^(2+)和Ca^(2+)能够显著增强酶活力。PulBa最适作用底物为普鲁兰糖,对马铃薯支链淀粉、玉米支链淀粉、可溶性淀粉和糖原也有一定水解活性,但对α-环糊精和β-环糊精和直链淀粉无活性。以普鲁兰糖为底物PulBa的K_(m)和V_(max)值分别为1.34 mg/mL和24.6μmol/(min·mg)。研究表明PulBa是典型的I型普鲁兰酶。薄层层析进一步证明,PulBa专一性水解支链淀粉α-1,6-糖苷键,产生麦芽三糖。本研究确定了一种新型的普鲁兰酶,该酶在高热稳定性和酸性环境下具有高活性,在淀粉加工等生物技术产业中有较好的应用潜力。

酸性普鲁兰酶基因在地衣芽孢杆菌中的表达

根据Genbank公布的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因突变体序列(AX203843)合成普鲁兰酶成熟肽基因。将该基因插入芽孢杆菌分泌型表达载体pHY-WZX,重组质粒转化地衣芽孢杆菌B60608,重组地衣芽孢杆菌实现普鲁兰酶分泌表达。对重组菌产普鲁兰酶的条件进行优化,以含2%药媒和8%甘油的培养基最适合普鲁兰酶表达。

地衣芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因的鉴定

对地衣芽孢杆菌基因组序列分析显示,其中标注为amyX的基因可能编码普鲁兰酶。以PCR方法,从地衣芽孢杆菌染色体DNA中扩增出amyX基因蛋白编码区,插入大肠杆菌表达载体pET28 a T7启动子下游。含重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG诱导下表达出有活性的普鲁兰酶。酶学性质初步分析表明,重组普鲁兰酶最适反应温度为40℃,最适pH值为6.0。

长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及酶学性质研究

根据NCBI上报道的基因序列设计引物,以长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)ATCC53909的染色体DNA为模板,PCR扩增普鲁兰酶编码基因pulB。将此基因与表达载体pWB980连接构建重组质粒pWB-pulB,并转化枯草芽孢杆菌WB600。SDS-PAGE结果显示,在100 kD处有特异性条带,经测定重组转化子粗酶液酶活力达10.94 U/mL。酶学性质分析表明,其最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0,且在温度30-60℃及pH4.0-6.0范围内稳定,适合淀粉加工行业的应用。

普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达

根据文献报道的核苷酸序列合成Bacillus deramificans普鲁兰酶成熟肽编码基因BdP。将BdP基因插入芽孢杆菌分泌表达载体pUC980信号肽编码区下游,获得重组质粒pUC980-BdP,重组质粒转化中温a-淀粉酶生产菌解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株。摇瓶发酵实验表明,重组转化子发酵液有明显普鲁兰酶酶活,约48 h酶活达到最高水平,为2.8 ASPU/mL。酶学性质分析表明,重组酶最适作用温度约为60℃,最适反应pH为5.0,60℃保温3 h仍保存50%的活性。重组酶性质适合淀粉糖化工艺的要求。

培养基及培养条件对普鲁兰酶的影响

从土壤中分离出一株产普鲁兰酶的菌株，初步鉴定为芽孢杆菌．通过优化发酵培养基及发酵培养条件，在２５０ｍＬ的摇瓶中可达到４．５μｍｏｌ／（ｍｉｎ·ｍＬ）的普鲁兰酶酶活．优化后的发酵培养基成分如下：玉米支链淀粉２ｇ／ｄＬ，蛋白胨２ｇ／ｄＬ，牛肉膏１．５ｇ／ｄＬ，ＮａＣｌ０．５ｇ／ｄＬ，ＭｎＳＯ４２μｍｏｌ／Ｌ．摇瓶发酵工艺条件：接种量１７％，温度３７℃，摇瓶转速２２０ｒ／ｍｉｎ，ｐＨ６．０，发酵周期３２ｈ．通过２Ｌ容积的发酵罐批式发酵，酶活可稳定在３．

苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因amyX的鉴定与重组酶性质研究

[目的]研究苏云金芽孢杆菌konkukian亚种amyX基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的性质。[方法]以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)染色体DNA为模板,PCR扩增得到amyX普鲁兰酶结构基因,再与大肠杆菌表达载体pET28a连接,构建能表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌。重组菌经IPTG诱导,表达有活性的普鲁兰酶,初步分析重组普鲁兰酶的酶学性质。[结果]结果表明,苏云金芽孢杆菌基因组序列有两条基因(pulA和amyX)可能编码普鲁兰酶。温度为50℃,pH为6.0时,重组酶不能水解淀粉,属于I型普鲁兰酶。[结论]amyX基因能在大肠杆菌细胞内成功表达,表达产物具有典型的I型普鲁兰酶的特性。

普鲁兰酶基因在毕赤酵母中组成型表达及定点突变研究

合成Bacillus acidopullulyticus的全长普鲁兰酶基因并在毕赤酵母X-33中进行组成型外分泌表达,重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用pH值为4.5～5.0,酶比活力为2.0 U/mg。采用重叠延伸PCR方法对普鲁兰酶基因进行定点突变,实验结果表明,625、626位点Ala、Leu氨基酸突变为Leu、Tyr氨基酸后,该酶的催化效率有所降低,而Gln487Ala的突变对催化效率没有较大的影响。该研究结果为探究关键氨基酸区域对催化效率的影响提供了一定的理论和实验基础。

一种耐酸热普鲁兰酶生产菌种的分子构建及发酵研究

将长野芽胞杆菌的普鲁兰酶基因经密码子优化后,组建了人工合成的二联启动子Pga2,并将它克隆到枯草芽胞杆菌穿梭质粒p MK4-BPB以及自杀质粒p GE-BPB中;经转化和筛选获得了中性蛋白酶基因npr E被敲除的普鲁兰酶生产菌株CH-1;该重组菌在基础培养基中所产普鲁兰酶的酶活达到30.3 U/m L;经过对培养基组分及发酵条件(培养温度、起始p H,起始接种量等)进行优化,确定了发酵的最适碳源为45 g/L的蔗糖,氮源为60 g/L的麸皮+豆粕时,设定初始培养基的p H为6.2,在培养温度为32℃时进行发酵,CH-1发酵产重组普鲁兰酶酶活高达268 U/m L。

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外。重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积累在大肠杆菌胞质内的产物有明显的差异,分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的重组酶BsBsP的比酶活为153.7 U/mg,是大肠杆菌胞质内产物的5.5倍。重组酶BsBsP最适pH为6.0,最适温度为45℃。重组酶BsBsP对直链淀粉无降解作用,为I型普鲁兰酶。在以土豆淀粉为原料的粉丝制作工艺中,以重组酶BsBsP水解芡糊淀粉可以有效降低粉丝断条率。枯草芽孢杆菌普鲁兰酶可利用自身结构实现高效分泌表达,重组酶适用于以淀粉为原料的粉丝制作。