环状RNA编码蛋白质在胃肠肿瘤中的研究进展

环状RNA(CircRNA)是一类具有连续、共价闭合、环状结构的单链RNA,生成机制与线性RNA存在较大差异。目前研究已发现部分CircRNA可以通过内部核糖体进入位点、N6-甲基腺苷和滚环翻译等非帽依赖性蛋白翻译机制来编码蛋白质,且编码的蛋白质可进一步通过蛋白诱饵或其他作用机制来调控同源线性蛋白质或下游信号通路,进而发挥生物学功能。已有研究表明CircRNA在各种疾病发生发展中发挥重要作用,特别是参与肿瘤生长增殖、侵袭转移和免疫调节等发生发展过程中。因此,通过阐明编码CircRNA产生的蛋白质在肿瘤发生发展中的表达情况和作用机制,有望为肿瘤诊治提供新的肿瘤标志物和潜在靶点。

酶解啤酒废酵母生产橘小实蝇蛋白饵剂的研究

水解蛋白液是橘小实蝇蛋白饵剂的核心组成成分,研究利用酶解法从啤酒废酵母中提取水解蛋白的加工工艺。通过正交试验,对水解温度、pH、时间和加酶量4个水解影响因素进行分析,结果显示,最佳工艺条件为pH值6.0,温度50℃,时间18h,加酶量为2.0mg/mL。室内生物测定的结果表明,水解蛋白液对橘小实蝇的引诱率可达60.00%,其中雌性和雄性的引诱率分别为63.30%和56.70%。总糖与蛋白质含量的比例是影响引诱率的重要因素,当二者之比为200:1时,引诱率最高。

橘小实蝇蛋白饵剂的生物测定

测试了蛋白饵剂对橘小实蝇的引诱活性,并结合田间应用,研究稀释倍数、添加挥发性化学物质对其引诱率的影响。室内生物测定结果表明,蛋白饵剂对5日龄橘小实蝇的引诱效果最佳,引诱率可达60.00%,其中雌虫和雄虫的引诱率分别为63.30%和56.70%;效果与Prima相当,优于GF-120,后两者的引诱率分别为62.50%和44.20%。稀释后引诱率会不同程度地下降,稀释2倍的应用效果最佳,引诱率为53.30%,仅下降了6.70%;添加一定量乙酸乙酯、番石榴香精和甲基丁香酚可显著提高引诱率,三者的最佳比例分别是3%,4%和5%,引诱率分别为71.70%,63.30%和71.70%。室外生物测定结果表明,蛋白饵剂12 h内的引诱率可达80.00%,最佳使用环境温度为25～28℃。

酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。

甲基丁香酚和蛋白饵剂对海南杨桃园橘小实蝇诱控效果研究

于2010年6～9月采用甲基丁香酚诱杀雄成虫和蛋白饵剂诱杀雄、雌两性成虫的方法,开展了海南杨桃园橘小实蝇种群动态与诱控效果的研究。结果表明:橘小实蝇成虫发生高峰在7月中下旬,与杨桃1造果成熟期相吻合;橘小实蝇的种群密度与杨桃果实被害率明显呈正相关。表明采用诱杀两性成虫与及时处理落果等农业措施相结合的技术防治杨桃园橘小实蝇的效果显著,在不套袋和不施用农药的情况下2造杨桃保果率达81.3%。

拒避-诱杀组合技术对橘小实蝇产卵的影响

本文研究了以矿物油(mineral spray oil)乳剂为保护剂、"猎蝇"蛋白质毒饵为诱杀剂组成的拒避-诱杀组合技术对橘小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)产卵的控制作用。结果显示:橘小实蝇在采用拒避-诱杀组合技术保护的供试香蕉上平均产卵孔数为0.000±0.000个,果实完好率达到100%,而单独使用"猎蝇"蛋白质毒饵的平均产卵孔数为27.000±1.732个,果实完好率仅为5.55%,表明该组合技术对橘小实蝇产卵的控制效果显著。在100倍～300倍浓度范围内,矿物油浓度越高,拒避-诱杀组合对橘小实蝇产卵的控制效果越好;随着虫口密度的增加,毒饵使用量和施用面积也须相应增加,才能取得更好的防治效果。

蛋白饵剂对橘小实蝇辐照不育雄虫的引诱作用

以橘小实蝇为研究对象,研究蛋白饵剂对不同日龄、不同释放密度不育雄虫的引诱作用,以及施用蛋白饵剂后不同时间、添加多杀菌素对不育雄虫的引诱效果。结果表明,蛋白饵剂对不育雄虫的引诱率明显低于同日龄正常雄虫,5日龄时最高,分别为36.24%和48.93%,且随着日龄的增加,引诱率会不同程度下降。不育雄虫释放密度对引诱率无显著影响,0.25～1.00头/m2的释放密度下引诱率为33%～58%。不论是挂瓶法引诱,还是混入0.02%多杀菌素后点喷,蛋白饵剂对不育雄虫的引诱效果均随蛋白饵剂施用天数的增加而逐渐下降,挂瓶法前2d引诱的不育雄虫数量占总引诱数量的65%,添加多杀菌素法该比例则达到80%,5d后这2种方法不再有引诱效果。残留的多杀菌素对不育雄虫无触杀作用。

橘小实蝇蛋白饵剂中添加农药的室内毒力测定

蛋白饵剂中添加高效低毒农药已成为国内外防控实蝇类害虫的一项重要措施,为筛选高效低毒、与蛋白饵剂兼容性好的农药,在实验室条件下,采用药膜法和饵剂加毒法分别测定了多杀菌素、马拉硫磷、阿维菌素、虫螨腈和乙虫腈5种农药对橘小实蝇Bactrocera dorsalcs的触杀和胃毒作用.触杀试验结果表明,多杀菌素的触杀效果最好,LC50为72.33 mg.L-1,95%置信区间为52.84～101.48 mg.L-1.其他农药的触杀作用效果顺序为:阿维菌素>马拉硫磷>乙虫腈>虫螨腈.胃毒试验结果表明,阿维菌素和多杀菌素的胃毒作用效果较好,LC50分别为13.99和15.76 mg.L-1,95%置信区间范围分别为11.72～16.97和13.09～19.23 mg.L-1.其他农药的胃毒作用效果顺序为:虫螨腈>乙虫腈>马拉硫磷.生物测定结果表明,添加农药后,水解蛋白的引诱效果会不同程度地下降,添加多杀菌素后引诱效果最好,引诱率达到55.83%,与水解蛋白原液相比,引诱率仅下降了4.17%.

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_MYC2构建及表达鉴定

MYC2是一类含有helix-loop-helix(bHLH)结构域的转录因子。为进一步研究MYC2因子在植物防御抗性中的作用及其参与植物JA,SA等信号途径的作用机制,克隆了拟南芥的MYC2基因,以此构建了pG-BKT7_MYC2酵母双杂交载体,通过Western blotting验证表明,该载体能在酵母细胞里正常表达。

橘小实蝇蛋白饵剂田间应用及效果评估

应用橘小实蝇蛋白饵剂主要有悬挂诱集瓶和点喷两种方式,为了提高田间应用效果,研究了稀释倍数、使用量和周期等对引诱效果的影响。结果表明,悬挂诱集瓶和点喷使用时,稀释2倍的效果最佳;对橘小实蝇的引诱效果均随着使用量的增加而增加,最佳使用量分别为15mL和30mL;使用周期均为5d。悬挂诱集瓶试验结果中发现,适当提高pH可提高引诱效果,pH为6时引诱效果最佳,引诱数量为6.67头,其中雌虫和雄虫分别为4.67头和2.00头;比较不同寄主果园和不同地点中应用效果时发现,杨桃果园里的引诱效果比柑橘和蜜柚果园好,引诱数量为5.00头;公园、果园和校园的引诱数量分别为11.73、7.00头和5.33头。点喷应用的试验结果表明,添加量为0.20%马拉硫磷效果最佳,成虫死亡数量为7.67头。

羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测

[目的]构建含羊布鲁氏菌16M Omp25基因的酵母双杂交诱饵质粒,检测诱饵质粒表达产物对cdc25H酵母细胞有无毒性作用以及对报告基因有无激活作用。[方法]聚合酶链反应(PCR)扩增布鲁氏菌Omp25基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos上,构建诱饵重组质粒pSos-Omp25,经测序正确后,将其将转化到酵母菌cdc25H感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。[结果]序列测定证明重组诱饵质粒pSos-Omp25构建成功;重组质粒表达产物对cdc25H酵母细胞无毒性,对报告基因无激活作用。[结论]利用SOS恢复系统(SRS)成功构建了羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵质粒,为筛选与羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白相互作用的蛋白创造了条件。

脑心肌炎病毒VP1蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及验证

为筛选与脑心肌炎病毒VP1蛋白相互作用的靶细胞cDNA文库蛋白,构建VP1蛋白的诱饵载体pDHB1-VP1。扩增EMCV的VP1基因并克隆至pMD18-T载体中,经测序验证正确后定向克隆至酵母双杂交诱饵载体pDHB1。将重组pDHB1-VP1载体进行酶切验证和测序分析,并转化酵母报告菌株NMY51,检测其在酵母细胞中有无表达和自激活作用。结果表明,构建的p DHB1-VP1基因可以在酵母细胞中正确表达,产物大小约66 kD,而且可以与兔抗EMCV血清发生特异性结合,有较好免疫原性。成功构建了诱饵载体pDHB1-VP1,可以在酵母细胞中表达且其对报告基因无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选试验中。

维甲酸受体变异蛋白酵母双杂交诱饵载体构建

目的构建维甲酸受体变异蛋白(RARα-V)的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与RARα-V相互作用的蛋白建立实验基础。方法PCR扩增RARα-V,克隆入诱饵载体pGBKT7中,将构建好的诱饵载体pG-BKT7-RARα-V转化到酵母细胞AH109中,并利用蛋白印迹法(Western Blotting)分析诱饵蛋白的表达情况。同时检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用。结果成功扩增了RARα-V基因片断,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性,无自激活和渗漏,Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白。结论成功构建了RARα-V结合域的酵母诱饵表达载体,为进一步筛选与之相互作用的蛋白提供基础依据。

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-PML-V的构建、表达及鉴定

目的:构建早幼粒细胞白血病基因变异蛋白(Promyelocytic leukemia,PML-V)的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)筛选与PML-V相互作用的蛋白建立实验基础。方法:PCR扩增PML-V,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7-PML-V转化到酵母细胞AH109中,并利用蛋白印迹法(Western Blotting)分析诱饵蛋白的表达情况。同时检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用。结果:成功扩增了PML-V基因片断,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用,Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白。结论:成功构建了PML-V结合域的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。

Survivin基因诱饵表达载体的构建和鉴定

目的构建Survivin基因诱饵表达载体,为建立酵母双杂交系统筛选Survivin蛋白靶蛋白奠定基础。方法从人K562细胞中提取总RNA作为模板,逆转录得到Survivin cDNA,通过特异引物扩增Survivin基因的ORF区,然后与诱饵表达载体pGBKT7连接,构建诱饵表达载体pGBKT7-Survivin,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-Survivin转化到酵母AH109细胞中,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况。同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用。结果成功扩增了Survivin基因的ORF区,并成功将其克隆到诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Westernblot分析证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白。结论成功构建了Survivin基因的ORF区的酵母诱饵表达载体,为建立酵母双杂交系统筛选Survivin蛋白靶蛋白奠定基础。

糖皮质激素受体结合域诱饵表达载体的构建及鉴定

目的构建糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合域的诱饵表达载体。方法RT-PCR扩增GR结合域,克隆入pMD18-T,测序正确后,再亚克隆入诱饵载体pGBKT7中,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-GR转化到酵母AH109细胞中,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用。结果成功扩增了GR结合域,并分别成功克隆到pMD18-T和pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Western blot分析结果也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白。结论成功构建了GR结合域的酵母诱饵表达载体。

人HL-60细胞GR-αLBD诱饵表达载体的构建和鉴定

目的:构建糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)受体α配体结合域(GRα-LBD)的诱饵表达载体,为小分子配体酵母三杂交系统的建立奠定基础。方法:RT-PCR扩增HL-60细胞的GRα-LBD,克隆入诱饵载体pGBKT7中,测序正确后,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-GRα-LBD转化到酵母AH109细胞中,提取酵母蛋白,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况。同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用。结果:成功扩增了GRα-LBD,并成功亚克隆到pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Western blot分析也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白。结论:成功构建了GRα-LBD酵母诱饵表达载体,为建立小分子配体酵母三杂交系统奠定了基础。

协同激活分子CBP诱饵表达质粒的构建和鉴定

构建协同激活分子CBP(CREB(cAMP response element binding)binding protein)的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.PCR扩增小鼠CBP的基因编码序列(CDS(coding sequence)序列)并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,通过酶切和测序鉴定后,把构建好的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP转化到酵母AH109细胞中,Western blot检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果成功扩增了小鼠CBP基因的CDS序列,并成功克隆到酵母诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果正确.诱饵表达质粒成功转化到酵母AH109细胞中,Western blot分析结果证实酵母细胞高表达诱饵蛋白CBP,但诱饵蛋白有自激活作用.提示pGBKT7-CBP不能用于酵母双杂交或三杂交系统检测CBP与其他蛋白质或小分子的相互作用,对其他研究CBP生物学功能试验的方法选取具有一定的借鉴意义.

eSRK_s酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

为研究甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域高变区(eSRKs)的相互作用,构建了eSRKs基因的酵母双杂交诱饵载体,检测其自激活作用,并验证是否适用于后续的相互作用研究.以甘蓝B3为材料,通过RT-PCR技术获得eSRKs目的基因片段,将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-eSRKs;测序正确后,将重组质粒转入Y2HGold,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性以及对报告基因有无自激活作用,结果获得了正确的eSRKs基因片段,并成功克隆到pGBKT7诱饵载体中,且转化在有诱饵载体pGBKT7-eSRKs的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明表达产物对酵母细胞无毒性;显色反应结果表明对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测SCR蛋白与SRK蛋白胞外域高变区的相互作用奠定基础.

筛选和鉴定抗卵巢癌活性六肽的靶点蛋白

目的采用pull-down技术筛选乳源抗癌六肽(PGPIPN)在人卵巢癌细胞株(SKOV3)上的靶点蛋白(受体)并进行鉴定。方法以PGPIPN的序列为参照,设计出PGPIPN基因,以BamHⅠ/XhoⅠ为酶切位点,将PGPIPN基因构建到表达质粒载体pGEX-4T-1中,转化到E.coli BL21中,用诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)低温诱导表达的谷胱甘肽S转移酶(GST)标签融合蛋白作为诱饵蛋白;从SKOV3中提取的总蛋白作为捕获蛋白,运用GST pulldown技术,筛选出靶点蛋白质,运用SDS-PAGE电泳进行初步鉴定,并用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的PGPIPN孵育鉴定。结果 SDS-PAGE电泳中有两条条带,一条为诱饵蛋白,一条为目的条带,在免疫荧光显微镜下观察到荧光PGPIPN结合到该条带上。结论筛选和鉴定了PGPIPN作用于卵巢癌细胞上的靶蛋白,为研究其抗癌的作用机制及其信号转导通路奠定了基础。